醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达重组大肠杆菌催化合成依鲁替尼手性中间体的研究

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光学纯的仲醇是一类重要的手性合成砌块,由于其具有活泼的羟基,故可以通过一些简单的修饰得到各类手性合成单元,作为重要的前体用于合成许多天然产物、农药、香精香料、材料、药物等。依鲁替尼(Ibrutinib)是一种靶向抗癌新药,抑制布鲁顿酪氨酸激酶活性,用于套细胞淋巴瘤的治疗。(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是合成依鲁替尼关键手性中间体。本文首先将来自Thermoanaerobacter brockii的醇脱氢酶基因(ADH)与来自Bacillus subtilis的葡萄糖脱氢酶基因(GDH),分别连接到pRSFDuet-1质粒的两个克隆位点上,构建了重组表达菌株,其能够实现ADH和GDH在细胞内的共表达和胞内辅酶NADPH的再生。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶在培养条件下均为可溶性表达,分子量分别为38和27 kDa,与文献报道的一致。其次,采用单因素优化的方法,从碳源、氮源、金属离子、诱导条件、初始pH、培养温度几个方面着手对重组工程菌的培养基与培养条件进行优化。最终优化的培养基成分为(g/L):可溶性淀粉30,酵母粉15,氯化钠5,初始pH调至6.0。优化的条件为:先在37~oC培养3 h后加入终浓度为0.025 mM的IPTG,继续在40~oC培养10 h。优化后,发酵液的酶活和细胞量分别为139.8 U/L和6.6 g/L,分别是优化之前的11倍和3.6倍。对等量的微生物细胞催化底物的不对称还原反应进行比较。优化后的培养基中培养的细胞催化反应时,50 mM的底物8小时的转化率达到95%。然而,在LB培养基中培养的细胞在同样条件下转化率仅为56%。最后,对所构建的工程菌整细胞催化合成手性药物中间体(S)-1-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的反应条件进行优化。重点考察底物浓度、pH、助溶剂、葡萄糖含量、辅酶添加量等因素对目标反应的影响。优化的反应条件如下:在50~oC、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L)中,反应体系中添加1.5倍底物摩尔当量的葡萄糖作为辅底物,5%甲醇充当助溶剂,辅酶添加量为0.1 mM时,转化率较高。1 mL体系中,反应2 h时,50 mM底物转化率为97.8%。底物浓度为250 mM,并用稀释的氨水控制反应过程中pH恒定时,1 h转化率即为98.5%。进一步将底物浓度提高至500 mM,反应时间至3 h,转化率达到96.2%。
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