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目的 分离、培养、鉴定晚期内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)。将晚期EPCs,作为种子细胞,研究晚期EPCs的生物学特性。制作小肠粘膜下层组织(small intestinal submucosa,SIS),并作为细胞外基质材料,研究与晚期EPCs在体外共培养的生物相容性,以及EPCs在SIS表面的生长情况。观察复合晚期EPCs的SIS构建的小口径人工血管的性能,以及修复兔颈动脉缺损的实验研究。方法 骨髓单个核细胞分离后以EGM-2MV培养,采用免疫组化、免疫荧光和流式细胞仪鉴定晚期EPCs相关标志CD34、CDl33、VEGFR-2和v WF的表达;Dil-ac LDL和FITC-UEA-1的摄取能力,MTT法绘制晚期EPCs生长曲线;Matigel胶测定晚期EPCs成血管功能;透射电镜观察晚期EPCs向内皮细胞转化的特征。SIS来自于猪的小肠,经过物理和化学的处理制备得到。用光学显微镜观察晚期EPCs在SIS上的生长形态,增殖率通过MTT测定。通过ELISA和免疫印迹法,测定晚期EPCs接种到SIS后生产血管生成素-1(ANG-1)和内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。将SIS膜以胶原蛋白和硫酸软骨素混合液粘接,并缝合制作SIS管。体外测试支架爆破压,溶血试验,对凝血时间的影响。接种晚期EPCs,并扫描电镜观察接种情况。移植入兔颈动脉缺损处,定期行彩超和DSA检查观察移植血管的情况。行组织学检查观察移植入的SIS管重塑情况,扫描电镜和荧光显微镜观察血管内皮细胞层情况。结果 早期EPCs呈集落样生长,晚期EPCs表现出鹅卵石形态,纺锤状的形状。晚期EPCs表面抗原标志物CD34,CD133,VEGFR-2,v WF表达为不同程度的阳性;流式细胞仪检测显示早期EPCs的CD133含量较高,后逐渐降低;晚期EPCs的VEGFR-2含量上升。晚期EPCs增殖明显,形成网状连接的管腔样结构。电镜下晚期EPCs可见到内皮细胞特征性细胞器-Weible-Palade(W-P)小体。光镜显示,机械和化学处理的小肠粘膜下层是由细胞外基质组成。晚期EPCs和SIS共同培养后,细胞增殖率明显提高,并能够在SIS上粘附,生长和增殖。共同培养后,ANG-1的分泌量在第1d时就较单纯的晚期EPCs组升高,随着时间的延长逐渐升高,到第7d时分泌量达到最高,后逐渐下降。VEGF的分泌量呈随着时间的延长逐渐升高后,一直稳定在较高的水平。免疫印迹分析进一步表明,晚期EPCs播种到SIS的表面上ANG-1和VEGF均有明显的升高。制作的SIS管有良好的爆破压,能够延长凝血时间,符合医用材料的溶血率试验要求,不会对血细胞造成破坏。接种的细胞能够在SIS管上生长。复合晚期EPCs的SIS管在8w时有50%的通畅率。组织学显示,SIS已经有很好的重塑反应,可见胶原纤维和平滑肌细胞。扫描电镜可见完整的内皮细胞层,部分内皮细胞来源于标记的晚期EPCs。结论 骨髓中存在不同特质的早期EPCs和晚期EPCs,晚期EPCs增殖强,具有成血管能力,能够转化为内皮细胞,有限的实验结果表明,晚期EPCs可能是一个有吸引力的诱导血管新生的候选细胞。SIS与晚期EPCs有良好的生物相容性,能够很好的促进晚期EPCs的生长。制作的SIS管能够符合移植血管的要求,在体内实验中能够很好的和宿主整合,并形成完整的内皮细胞层。