论文部分内容阅读
近几年，由于鸭病毒性肝炎（DVH）传播快、致病性强、血清型变异多，严重制约了养鸭业的发展。目前，检测该病最常用方法为聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。但这些方法存在着操作繁琐，耗时，敏感性低，准确性差等不足。因此建立一种能够应用于检测的DVH样本快速、简便、标准化的检测技术迫在眉睫。本世纪初就有人提出PCR-ELISA方法的研究。该方法结合了PCR和ELISA，并引入特异性探针，在有效的简化了操作步骤的同时对样品进行定性、定量分析，大大提高了检测结果的敏感性与特异性。PCR-ELISA技术在病毒分型，致病菌检测，克隆鉴定及分子生物学研究等方面有其独特的优势，如能将其应用于检测DVH，具有一定的研究意义及推广价值。世界范围内均有不同程度鸭病毒性肝炎疾病存在，目前本病还没有特效治疗药物。随着DHV的不断变异以及DHV分子生物学与基因工程技术的迅猛发展，从安全性、高效性等方面来考虑，研究推广基因工程疫苗将会有很好的前景。白细胞介素-2是众所周知的具有免疫治疗、免疫增强、免疫预防作用的细胞因子，迄今已有大量的实验报道，将IL-2应用于治疗动物性疾病的报到中。本研究成功克隆出DHV VP1基因，建立了检测DHV的PCR-ELISA方法，并通过互补的linker构建了表达载体pET-VP1-IL-2，进行了原核表达，为进一步研究鸭病毒性肝炎诊断及防控方法奠定了基础。具体研究结果如下：本试验成功克隆出DHV VP1基因，转化至大肠杆菌DH5ɑ中，经测序分析发现，序列大小为517bp。经同源序列比较分析发现，本试验获得的鸭肝炎病毒VP1基因片段与GenBank中已发表的鸭肝炎病毒基因型VP1（EF502171.1，EF502172.1）核苷酸序列同源性可达87.56%。从系统发生树上的位置关系可知：扩增的鸭肝炎病毒VP1核苷酸与GenBank数据库中发表的鸭肝炎病毒基因型VP1基因序列处于同一分支，推测属于同一种属。但与数据库中发表的基因Ⅲ型的核苷酸序列分属不同的系统发生树分支上，亲缘关系较远。本试验利用探针引物双标记法成功建立了DHV PCR-ELISA检测方法。并通过反复优化确定了10mg/mL链亲和素包被液、1%BSA封闭液、0.5pmol/L探针、1:4000稀释的酶标二抗及最适杂交时间等最佳反应条件。该方法较常规的RT-PCR敏感性高达100~1000倍，且特异性强，从而为鸭病毒性肝炎流行病学研究及临床诊断提供了新的途径。本试验通过linker成功构建原核表达载体pET-VP1-IL-2，并转化到表达菌株中，经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析，获得了VP1目的蛋白，该蛋白主要以包涵体形式存在，分子量大小约为40.6KD的。当IPTG终浓度为0.9mmol/L、37℃诱导4h时，VP1蛋白的表达量最高。