【摘 要】
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沙门氏菌是一种常见的食源性肠道致病菌,可以感染人畜并引发食物中毒、伤寒等疾病。在过去的几十年中,伴随着抗生素的过量使用,沙门氏菌对传统抗生素的耐药性急剧增强,所以针对沙门氏菌开发新型抗感染药物的需求也愈发迫切。新型抗感染药物的开发策略是:针对致病菌的关键致病元件进行靶向抑制,减弱其侵染能力或毒力,但并不影响细菌存活,从而降低病原菌致病能力并减缓耐药菌的产生。基于此策略,双组分系统（TCS）和Ⅲ型分
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沙门氏菌是一种常见的食源性肠道致病菌,可以感染人畜并引发食物中毒、伤寒等疾病。在过去的几十年中,伴随着抗生素的过量使用,沙门氏菌对传统抗生素的耐药性急剧增强,所以针对沙门氏菌开发新型抗感染药物的需求也愈发迫切。新型抗感染药物的开发策略是:针对致病菌的关键致病元件进行靶向抑制,减弱其侵染能力或毒力,但并不影响细菌存活,从而降低病原菌致病能力并减缓耐药菌的产生。基于此策略,双组分系统（TCS）和Ⅲ型分泌系统（T3SS）成为针对沙门氏菌开发抗感染药物的重要靶点。本研究分为两个部分,第一部分针对沙门氏菌感知环境压力调控GlcN6P合成、增强毒力效应的双组分系统QseEF的信号转导机制展开研究,第二部分针对致病毒力元件Ⅲ型分泌系统的核心组分SctV家族蛋白参与T3SS组装与底物分选的机制进行研究。本研究的主要内容与成果如下:1.通过构建QseF和QseE的不同截短体,成功获得QseEF胞内复合物,明确了QseF依靠RD结构域与QseE的DHp-CA结构域发生相互作用,其相互作用需要σ54相互作用域或者BeF3-的协助才可以发生;QseE磷酸基团结合位点His259突变为Glu259后也有助于其与QseF RD结构域形成复合物。2.由于膜蛋白自身的独特性质,体外重组表达的产量一般较低。本研究通过构建SctV蛋白嵌合体ISS（InvATM-SsaVL-SsaVC）解决了其表达量低的问题。除此之外,鉴于膜蛋白跨膜区域较强的疏水性,需要选择合适的去垢剂稳定其构象,为此本研究对不同的去垢剂进行筛选和组合,最终确定在去垢剂GDN中可以纯化获得稳定的符合生理状况下九聚体构象的嵌合体蛋白ISS,为进一步通过冷冻电镜技术解析其三维结构奠定了基础。3.利用细菌共表达体系获得了沙门氏菌SPI-2 T3SS分子伴侣/门控蛋白SpiC-SsaM/SsaL复合物,对该复合物进行限制性酶切实验发现SsaL的N端loop区是其与分子伴侣SpiC-SsaM相互作用的关键界面。4.SrcA是沙门氏菌SPI-2 T3SS分泌的多种效应蛋白的分子伴侣。本研究通过细菌共表达体系对潜在的结合SrcA的效应蛋白进行筛选,发现只有SteD可以与SrcA形成稳定的复合物,而SseL、PipB2、SseK2等效应蛋白在大肠杆菌表达体系中不能与SrcA形成稳定的复合物。本研究工作为理解双组分系统QseEF信号转导的机制以及SctV家族蛋白参与T3SS分泌过程的分子机制提供了实验基础,也为开发新型抗感染药物提供了理论支持。
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