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病毒性传染病严重威胁着公共卫生及人类与动物的健康。传统的抗病毒策略主要依赖于疫苗,例如灭活和减毒疫苗,但由于完整病毒的使用导致其生产和使用过程中存在较高的生物安全风险。此外,病毒结构蛋白免疫原性差和毒株序列高变异等原因导致某些疫苗的保护效果较差。病毒通过吸附、胞吞、脱壳、复制、装配与出芽过程完成其生命周期,而阻断病毒入侵宿主细胞被认为是最彻底有效的抗病毒策略。自20世纪70年代以来,基于病毒蛋白的结构和功能来干扰病毒与宿主受体的相互作用,继而实现安全有效的广谱抗病毒作用,逐渐成为抗病毒领域的研究热点。猪瘟（Classical swine fever,CSF）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）均是目前广泛流行的高度接触性传染病,对全世界的养猪业造成了重大的影响。猪瘟病毒（CSFV）的囊膜蛋白E2与病毒毒力紧密相关,是主要免疫原性蛋白,可介导CSFV入侵靶细胞,诱导机体产生高水平的中和抗体,且能从血清学上区分疫苗免疫和野毒感染动物,推动猪瘟的进一步净化。因此CSFV E2可作为病毒靶向阻断策略研究的优质模型。另一方面,可导致母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统障碍的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）,由于其高变异、易重组、免疫抑制等特性,导致现有病毒靶向阻断策略对其收效甚微,严重缺乏安全有效的疫苗及广谱抗病毒药物。研究表明清道夫受体CD163是PRRSV感染宿主细胞的主要受体,因此其可作为受体靶向阻断研究的理想模型。本研究分别基于病毒靶向和受体靶向的阻断策略,寻找安全有效广谱抗病毒药物,将为猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征的防控和净化提供新的思路。本研究中,首先以CSFV E2为模型评估病毒靶向策略的功效,一方面作为主动免疫策略,确定了携带新型信号肽的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的高效性和经济性。另一方面,开展被动免疫策略研究,基于E2ZJ的免疫优势,筛选获得3株靶向猪瘟病毒的广谱中和单抗,并评估了其体内外中和活性,抗病毒作用机制,抗原识别区域及功能。继而,为进一步提升阻断策略的通用保护作用,以CD163受体为模型评价了受体阻断策略的功效。制备了2株对PRRSV有广谱抗病毒作用的单抗,并对广谱抗病毒作用及其机制,体外的预防及治疗作用,抗原识别区域及其功能进行了进一步的评估。主要研究内容及结果如下:1.靶向病毒的主动免疫策略:新型高效猪瘟E2ZJ亚单位疫苗的研制鉴于猪瘟兔化弱毒疫苗不能区分免疫和感染动物,而猪瘟E2蛋白为主要的免疫原性蛋白。我们利用杆状病毒表达系统表达了融合新型信号肽的的E2蛋白。实验表明新型信号肽可促使E2蛋白在昆虫细胞中分泌表达。截短优化信号肽后发现,与其他截短信号肽相比,23aa长度的信号肽SPZJ（SP23）可诱导E2蛋白的表达量至少增加50%,且SPZJ信号肽对不同毒株的E2蛋白也具有促分泌功能。同等剂量不同毒株E2蛋白免疫小鼠后,经IFA和ELISA鉴定表明,与其他毒株的E2蛋白相比,E2ZJ可更早刺激机体产生猪瘟特异性抗体,且可诱导产生更高水平的中和抗体,其中和抗体效价在免疫28天后达到了1:2000。在仔猪攻毒实验中,单剂量免疫28天后,E2ZJ免疫组的猪瘟抗体阻断率高达75%以上,显著高于其他类型的猪瘟E2亚单位疫苗,同时产生了针对1型和2型毒株的高水平中和抗体。经强毒株攻毒后发现,与对照组比,免疫组均无猪瘟典型的体温反应、临床症状和组织病理变化,且单剂量5μg E2ZJ可对猪体提供针对石门毒株的100%保护作用。以上结果表明基于杆状病毒表达系统的猪瘟E2ZJ亚单位疫苗在蛋白表达量和免疫原性方面均具有优势,是一种经济高效的候选猪瘟亚单位疫苗。2.靶向病毒的被动免疫策略:猪瘟广谱中和单抗及其抗病毒机制的研究基于E2ZJ蛋白的免疫原性优势,通过传统的单克隆抗体筛选方法筛选出了一批具有中和活性的CSFV单克隆抗体。经IFA、Western-blot和ELISA鉴定后发现单抗6D10、8D8和3C12可特异性识别不同基因型的猪瘟病毒,且与不同型的CSFV E2蛋白均有较强的结合活性。此外三株单抗对不同的CSFV毒株具有广谱中和作用,且表现出良好的中和活性,即6.25μg/m L、3.125μg/m L和12.5μg/m L的剂量就可完全中和100 TCID50的CSFV,其中和作用呈一定的剂量依赖性。进一步的研究表明三株单抗具备多种高效的中和机制,即可抑制病毒的吸附和内化步骤从而阻断病毒的入侵。利用单抗与截短E2蛋白和E2蛋白突变体的反应性精确定位了三株单抗的线性中和表位分别为140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13和254HECLIG259,其中后两个表位为首次发现的新表位。序列比对后发现三个表位在不同毒株中高度保守,表明其具有鉴别诊断猪瘟病毒的潜在价值。空间结构预测和病毒捕获实验结果显示140TAVSPTTLR148、8YRYAIS13表位位于囊膜蛋白表面。携带抗原表位的重组多肽可在PK-15细胞上抑制猪瘟病毒感染,表明相应的抗原表位位于受体结合域,参与了病毒入侵受体的过程。另外,在家兔体内评估了中和抗体的对猪瘟病毒的预防性和治疗性作用,这进一步证实了中和抗体在体内中和作用的有效性。以上研究为靶向猪瘟病毒的广谱抗病毒策略提供了新的思路,加深了对猪瘟病毒入侵机制的理解。3.靶向受体的抗病毒阻断策略:基于CD163受体的PRRSV广谱抗病毒策略研究CD163受体是PRRSV入侵的关键受体,基于CD163受体的SRCR5-9结构域筛选获得两株可特异性识别重组SRCR5-9蛋白以及PAMs和Marc-145细胞上CD163受体的单抗6E8和9A10。两株单抗均能呈剂量依赖性的抑制PRRSV毒株的感染,且对流行株和疫苗株均有不同程度的抑制作用。作为预防和治疗PRRSV的候选药物,两种抗体均能在在病毒附着前后成功抑制PRRSV的感染及其相关的NF-κB通路。两株单抗作用后均可导致PAMs和Marc-145细胞中CD163的转录水平显著下降。这可能是由于抗体与CD163受体结合从而封闭了蛋白酶作用位点,导致膜相关CD163过度积累并负反馈抑制CD163转录生成。利用单抗与截短SRCR5-9蛋白和SRCR5-9蛋白突变体的反应性精确定位了单抗6E8和9A10识别的关键氨基酸,分别位于SRCR5上的570SXDVGXV576和SRCR7上的Q797残基。该关键氨基酸在不同种属的CD163中高度保守。通过在不支持PRRSV感染的3D4细胞中过表达野生型CD163和关键氨基酸突变的CD163突变体进一步验证了这些氨基酸残基在PRRSV入侵CD163受体的关键作用。此外,基于实验室前期筛选到的CD163受体的抗原表位,在细胞上初步评估了靶向CD163受体的多肽疫苗的抗病毒作用。以上研究加深了对PRRSV与CD163受体作用的理解,并为PRRSV的预防和治疗提供了新的广谱抗病毒策略。