研究背景毛发具有重要的生理及美容价值,目前治疗毛发缺损性疾病特别是雄激素性秃发最为有效的方法是自体游离毛发移植,但存在供区不足、供区瘢痕、移植密度低等问题。而毛囊组织工程的研究有望为临床各种类型不可逆性秃发的治疗提供一种比现行毛发移植术更加简便易行、微创且不受来源限制的全新治疗手段。毛囊是由上皮成分（包括毛母质、内根鞘和外根鞘）和真皮成分（包括毛乳头、真皮鞘）组成的。其中毛乳头细胞是构成毛乳头的主要间质细胞,它们是一簇特化的成纤维细胞。所有的毛乳头细胞在外观上都呈成纤维细胞样,而且体外培养的毛乳头细胞有着聚集性生长的特性。毛乳头在毛囊的形态学发生及周期调控中起着重要的作用。真皮鞘是围绕毛囊最外层的真皮源性组织,在毛囊的再生过程中,可以观察到真皮鞘细胞向毛乳头细胞的转化。有研究认为真皮鞘细胞是毛乳头细胞的储备细胞,毛乳头部位的真皮鞘细胞与毛乳头具有相同的诱导能力。毛囊隆突区（Bulge）与外根鞘相连续,并有研究证实毛囊Bulge区聚集了大量具有潜在增殖能力的早期幼稚细胞。被认为是毛囊干细胞的所在。已有研究证实,毛囊的形态学发生及周期性生长是毛囊上皮成分和真皮成分之间双相调节作用的结果。另有研究认为表皮干细胞在人体不同部位的皮肤分布差异,以包皮和阴囊皮肤表皮最多。并有日本学者将鼠毛囊真皮成分细胞和人包皮表皮细胞组合,进行裸鼠体内毛囊诱导重建获得成功,并有肉眼可见的毛发纤维长出。但尚无报道用人毛囊真皮成分细胞与人包皮表皮基底细胞组合进行此实验。Ⅰ型胶原蛋白是目前组织工程研究中最常用的天然生物材料,由多种糖蛋白分子组成,它具有多方面的生物活性,不仅是组织支持物,而且是细胞外间质的重要成分。研究表明,胶原蛋白生物相容性好,降解速度可调,而且可参与组织修复,是一类优良的可引导组织再生的生物材料。国内外许多毛囊生物学研究均用鼠尾胶原作为支架进行毛囊真皮细胞成分和表皮细胞成分组合器官型培养。但尚未报道采用用固体Ⅰ型胶原蛋白海绵作为支架进行毛囊种子细胞培养。DiI是一种亲脂性碳花青染料,易嵌入生物质膜内作侧向扩散运动,从而标记整个细胞膜,还可以通过活体细胞的胞饮作用进入胞浆,标记整个细胞浆。以往研究显示,DiI对活体细胞无毒性,对被标记细胞的存活、生长无影响。并有研究报道DiI可作为荧光示踪剂用于培养的神经细胞。随后又有DiI标记肝细胞、骨髓基质干细胞、脂肪干细胞等报道,但迄今未见有应用于标记毛囊细胞。研究目的1.建立高效、快速分离培养毛乳头细胞、真皮鞘细胞和毛囊上皮细胞,包皮表皮基底细胞的方法。2.选择适合于细胞生长的支架及细胞标记方法,建立毛囊细胞器官型培养的模型。3.探索有效的动物体内毛囊重建的方法。研究方法1.人毛囊真皮成分和表皮成分细胞的分离、培养和鉴定。将人头皮标本剪成小块,中性蛋白酶中37℃孵育2 h后镜下将带外根鞘的毛干从真皮鞘中拔出,组织块法培养外根鞘隆起（Bulge）细胞;从真皮-皮下组织交界处横断头皮,拔出含毛乳头的真皮鞘,胶原酶D 37℃孵育6～8 h,多次低速离心,毛乳头沉淀重悬后培养,收集的真皮鞘细胞上清液经高速离心后重悬培养;真皮鞘和毛乳头的分离也可采用显微解剖法,依参照文献中的操作进行。观察其在体外培养的形态学和生物学特点,比较两种分离方法毛乳头的贴壁率,培养的Bulge细胞和毛乳头、真皮鞘细胞分别用K19或α-平滑肌动蛋白免疫组化鉴定。2.鼠触须毛乳头细胞和鼠触须毛囊上皮细胞的分离、培养。采用显微解剖法进行大鼠触须毛乳头细胞分离、培养,大鼠麻醉后修剪颊侧被毛,常规消毒后剪去全层皮肤,暴露其下方的触须毛囊,然后用镊子将其完整拔出,用显微解剖法分离毛乳头。将分离的毛乳头置入含15%FCS的DMEM培养基,以适当密度接种（每个35 mm培养皿含10个毛乳头）,观察其在体外培养的形态学和生物学特点。鼠触须毛囊上皮细胞的分离、培养:参照文献中的操作进行,无菌条件下取7日龄Wistar大鼠触须部皮肤,镜下将毛囊从组织中分离出来,置入0.125%Dispase消化液中,4℃消化2 h后,镜下轻压毛球部即可将毛囊外根鞘及毛干完整地分离出来。切去带外根鞘的毛干中下段和上段,保留Bulge区毛囊。将分离的Bulge区毛囊置入无血清的K-SFM培养基中培养。观察其在体外培养的形态学和生物学特点。3.包皮表皮基底细胞的分离、培养。采用Ⅳ型胶原快速粘附法培养包皮表皮细胞。包皮标本用含双抗的D-Hanks液反复冲洗,室温下浸泡30 min,剔除皮下组织,将包皮剪成1.0 cm×0.5 cm大小皮条,置0.5%的中性蛋白酶中,4℃消化12～15 h,PBS冲洗2次,将表皮层撕下,剪成1mm×1mm大小皮片,置0.25%胰酶中,37℃消化5 min左右,中止消化,过200目筛网,计数,离心,重悬,接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中,室温下静置10 min,换液,吸附未贴壁的角质细胞。观察其在体外培养的形态学和生物学特点。4.细胞胶原凝胶制备。取传代培养数次（＜4代）的鼠毛囊毛乳头细胞和外根鞘细胞分别为6×10⁵和3×10⁵（真皮细胞与上皮细胞比例为2:1）梯度离心后加入0.5 ml胎牛血清。吸4 ml鼠尾胶原（质量浓度为1.0～1.5ml）于冰浴中的青霉素小瓶中,加入0.5 ml浓缩10倍的DMEM培养基,1N NaOH调Ph,立即加入含鼠毛囊毛乳头细胞和外根鞘细胞的胎牛血清细胞悬液,快速混合,制成细胞胶原凝胶,然后吸到35 mm培养皿中。静置于37℃、体积分数为0.05的CO₂孵箱培养。5.用DiI标记人毛囊毛乳头细胞和外根鞘细胞,包皮表皮基底细胞。将收集细胞用PBS清洗离心2次,加入无血清的DMEM制成细胞悬液,以1×10⁹/L密度加入5μL DiI应用液,37℃下孵育25 min,1500 r/min离心5 min,PBS清洗离心2次,加入10%DMEM培养基中,荧光显微镜观察细胞显色情况,置于37℃、体积分数为0.05的CO₂孵箱培养,观察24,48,72 h细胞荧光强度及形态变化。6.细胞—支架复合物的形成。将Ⅰ型胶原蛋白海绵支架材料裁制成10 mm×10mm×10 mm大小,利用紫外线照射及酒精浸泡消毒,培养液平衡后待用。DiI标记的人毛乳头细胞和外根鞘细胞、包皮表皮基底细胞消化后制成细胞悬液,分两组（毛乳头细胞+外根鞘细胞组、毛乳头细胞+包皮表皮基底细胞组,真皮成分细胞和表皮成分细胞数比例为2:1）,细胞密度为2×10⁵/ml,表面种植1 ml细胞悬液,静置4 h后,加入含20%胎牛血清的DMEM培养液,37℃、5%CO₂培养箱中培养。采用倒置相差显微镜和扫描电镜,观察细胞在支架上黏附、生长情况。7.裸鼠体内诱导实验。将鼠毛囊细胞胶原凝胶在无菌条件下注射移植到裸鼠背部两侧的皮下。于4周切下移植部位皮肤,石蜡切片行H-E染色光学显微镜下观察;人细胞—支架复合物在无菌条件下注射移植到裸鼠背部两侧的皮下,分别于6、8、12周切下移植部位皮肤,冰冻切片和石蜡切片荧光显微镜下观察,并进行H-E染色光学显微镜下观察。研究结果1.结合运用显微法和酶消化法等基本分离技术,同时从头皮毛囊标本中分离培养毛囊三种细胞成分,获得了较纯化的外根鞘Bulge细胞,真皮鞘细胞和毛乳头细胞。酶消化法获得的毛乳头贴壁率高,可达到90%,毛乳头和真皮鞘细胞体外培养表现出明显的凝集性生长,α-SMA免疫组化染色呈现阳性。组织块法培养的头皮毛囊外根鞘Bulge细胞,可在K-SFM培养基中生长良好,呈铺路石样。角蛋白19免疫组化染色阳性。2.采用显微解剖成功分离大鼠触须毛乳头细胞,细胞体外培养表现出明显的凝集性生长。采用酶消化法和显微解剖法成功分离到大鼠触须毛囊上皮细胞,可在K-SFM培养基中生长良好,呈铺路石样。3.采用Ⅳ型胶原快速粘附法培养的包皮表皮基底细胞外培养过程中呈典型的克隆性生长,生长周期长。4.刚接种于胶原凝胶的细胞呈圆形,在胶原凝胶内均匀分布。24 h内细胞伸展,粘附,2 d后部分细胞已伸展变形,以三角形和梭形为主。5.DiI标记的人毛乳头细胞、外根鞘细胞和包皮表皮基底细胞荧光显微镜下观察,见全部细胞标记后均显红色荧光,标记的细胞呈梭形或圆形,胞浆丰富,保持了良好的正常形态,DiI标记阳性率为100%。DiI标记后早期细胞形态呈荧光环状,48 h后细胞中荧光颗粒增多,荧光增强,细胞核未染荧光。6.细胞—支架复合物体外倒置显微镜下和扫描电镜观察,将毛乳头细胞、毛囊外根鞘细胞和包皮表皮基底细胞在材料上接种并在孵箱孵育2 h后,材料周边及孔板底部开始有细胞黏附,随着时间的延长,附着于材料上的细胞逐渐增多;培养2-3天后,细胞在材料上逐渐伸出突起,可见大量细胞附着于材料的孔隙及材料周边,胶原蛋白材料上皆有细胞附着,细胞呈梭形圆形或多角形,部分材料上的细胞呈团簇状生长,粘附于胶原海绵壁上或孔隙内,各细胞或细胞团之间通过基质相连或重叠。细胞种植3 d后,细胞呈扁平多角形或圆形,在材料表面伸展、黏附,种植1周后,形态为梭形或圆形,细胞数量明显增多,呈聚集性分布,细胞周围有大量基质。7.裸鼠体内诱导实验。裸鼠背侧皮肤观察未见有肉眼可见的毛发纤维生成。石蜡切片光学显微镜下观察发现鼠细胞胶原凝胶诱导实验组和人细胞-Ⅰ型胶原蛋白支架复合物毛乳头细胞与毛囊上皮Bulge细胞组合、毛乳头细胞与包皮表皮基底细胞组合诱导实验中4周、8周、12周均可见新生毛囊样结构形成。空白支架对照组无毛囊样结构生成。石蜡切片荧光显微镜下观察DiI标记的人毛乳头细胞、外根鞘Bulge细胞组合和DiI标记的人毛乳头细胞、包皮表皮细胞组合实验组新生毛囊样结构显红色荧光。未用DiI标记的实验对照组新生毛囊样结构无红色荧光显示。研究结论1.结合运用显微解剖法和酶消化法等基本分离技术,避免了单独运用显微法和酶消化法的缺点,并在分离步骤和次序上进行改进,首次同时从头皮毛囊标本中分离培养毛囊三种细胞成分,最大限度的利用了标本量,毛囊毛乳头因为经过胶原酶的处理,其贴壁与融合时间与文献报道的两步酶法无明显差别。因毛囊各种细胞成分来源于同一标本,进行细胞组合诱导等毛囊试验时避免了毛囊各细胞因来源不同而在毛囊组织工程中组合应用可能面临的免疫原性问题。2.经Ⅳ型胶原快速粘附法多次筛选的包皮表皮细胞外培养过程中呈典型的克隆性生长,生长周期长。说明用这种方法培养筛选的包皮表皮基底细胞可能含有较多的未分化表皮干细胞。3.DiI标记的人毛乳头细胞、外根鞘细胞和包皮表皮基底细胞标记阳性率为100%。细胞在Ⅰ型胶原蛋白支架上形态为梭形或圆形,呈聚集性分布,细胞周围有大量基质,表明细胞在支架上粘附、伸展和生长良好。4.裸鼠体内诱导实验组织切片观察DiI标记的人毛乳头细胞、外根鞘Bulge细胞组合和DiI标记的人毛乳头细胞、包皮表皮基底细胞组合实验组新生毛囊样结构显红色荧光。未用DiI标记的实验对照组新生毛囊样结构无红色荧光显示。证明了新生的毛囊是由细胞支架复合物诱导生成。