一、研究目的:1.肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC,简称肾癌）占肾脏恶性肿瘤的80%～90%,占成人恶性肿瘤的比例约4%。肾癌的发病机制尚不十分清楚。有研究发现,非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）在肾癌发病机制中具有重要的调控作用。2.micro RNA（mi RNA）是一种被广泛研究的nc RNA,通过调控下游靶基因的表达,参与肿瘤的增殖、转移、分化、凋亡等生物学进程。前期研究发现,mi R-140-5p在肾癌患者的癌组织中表达显著上调,且在体外促进肾癌细胞的增殖和转移。3.前期研究还发现,Krüppel样转录因子9（Krüppel-like factor 9,KLF9）是mi R-140-5p的靶基因,KLF9在肾癌中的作用尚未明确。因此,KLF9是否介导mi R-140-5p参与调控肾癌的增殖和转移及其分子机制值得深入研究。二、研究方法:1.临床病理标本:样本来源于北京大学深圳医院2014～2018年肾癌根治性切除术的全部（216例）肾癌临床样本,获取的癌旁组织距离癌组织边缘5cm以上。本研究经北京大学深圳医院伦理委员会批准。所有患者均同意他们的器官组织可以被用于本实验研究和论文展示,并在采集样本前签署了知情同意书。随机选取74例肾癌患者的癌组织及其邻近的癌旁组织。患者术后3～5年内总生存期由术后电话及门诊随访。患者术前术后均未接受过放疗、化疗、免疫治疗或靶向治疗。2.细胞学研究采用肾癌细胞系（786-O、769-P）、正常肾小管上皮细胞系（HK-2）及人胚肾上皮细胞系（293-T）。分别采用mi R-140-5p的抑制剂（mi R-140-5p inhibitor）和mi R-140-5p模拟物（mi R-140-5p mimic）转染细胞实现mi R-140-5p的敲低和过表达;KLF9的敲低采用短发夹RNA（short hairpin RNA,sh RNA）载体转染细胞完成;过表达由c DNA克隆技术构建载体转染细胞完成。应用实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测基因在组织样本和细胞中的表达水平。Cell counting kit-8（CCK-8）实验和平板克隆集落形成实验用于检测肾癌细胞的增殖情况;划痕试验和transwell实验用于评估肾癌细胞的迁移和侵袭能力。采用蛋白质免疫印迹和免疫组化检测组织和细胞中蛋白的表达情况。采用慢病毒载体转染786-O细胞构建稳转株,分别构建裸鼠皮下成瘤模型及裸鼠肺转移瘤模型。分子机制研究采用了染色质免疫沉淀实验和双荧光素酶实验等。3.统计学上对肾癌的癌组织与癌旁组织中基因表达差异的相关分析中采用配对样本t检验;在肾癌细胞或肾癌组织中进行的组间基因表达差异的分析中采用独立样本t检验;总生存率和无病生存率分析采用Kaplan-Meier法分析;肾癌患者临床病理特征与mi R-140-5p表达水平相关性的分析采用卡方四格表检验方法;两基因间表达相关性分析采用回归分析。三、研究结果:1.mi R-140-5p在肾癌中的作用:RT-q PCR实验发现,在74例肾癌患者的癌组织中,mi R-140-5p的表达水平显著高于癌旁组织;mi R-140-5p在癌组织中的表达水平与肿瘤体积呈正相关;mi R-140-5p在发生术后转移的患者癌组织中表达高于未转移的患者;mi R-140-5p高表达组患者的生存时间显著低于低表达组。CCK-8实验与平板克隆集落形成实验显示,敲低mi R-140-5p后,肾癌细胞的增殖数量显著低于对照组;相应地,过表达mi R-140-5p后,肾癌细胞的增殖数量显著高于对照组。划痕实验和transwell实验表明,敲低mi R-140-5p后,肾癌细胞的迁移力和侵袭力显著降低;过表达mi R-140-5p后,肾癌细胞的迁移力和侵袭力显著升高。裸鼠皮下成瘤模型中,mi R-140-5p敲低组786-O细胞在体内的增殖力显著低于对照组;裸鼠肺转移瘤模型中,mi R-140-5p敲低组肺部转移瘤的结节数量显著低于对照组。2.KLF9是mi R-140-5p的功能性靶基因:RT-q PCR及蛋白质免疫印迹实验提示,在肾癌中mi R-140-5p与KLF9的表达水平呈负相关。双荧光素酶实验显示,mi R-140-5p与KLF9 m RNA的3’UTR特异性结合,抑制KLF9的表达。CCK-8实验和平板克隆实验显示,单独敲低mi R-140-5p后肾癌细胞的增殖数量显著低于对照组,同时敲低mi R-140-5p和KLF9后,肾癌细胞的增殖数量较mi R-140-5p敲低组显著增加。划痕实验和transwell迁移实验表明,敲低mi R-140-5p后肾癌细胞的迁移距离和迁移的数量显著降低,而同时敲低KLF9后,细胞的迁移能力增加。Transwell侵袭实验示,敲低mi R-140-5p后肾癌细胞穿透基质胶产生侵袭的细胞数显著低于对照组,而同时敲低KLF9后,肾癌细胞的侵袭力增加。3.KLF9促进KCNQ1的转录:利用生物信息学筛选发现,KCNQ1（又称Kv7.1或Kv LQT1）是KLF9潜在的靶基因。TCGA数据库分析、RT-q PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,肾癌组织、细胞中KLF9的表达水平与KCNQ1的表达水平呈正相关,KCNQ1的表达水平与mi R-140-5p的表达水平呈负相关。体内研究中,RT-q PCR和免疫组化实验也表明,mi R-140-5p敲低后,小鼠肿瘤组织中KLF9和KCNQ1的表达水平显著升高。染色质免疫沉淀实验及双荧光素酶实验显示,KLF9与KCNQ1启动子区域的-841/-827位点结合,且KCNQ1的转录活性对KLF9存在剂量依赖性的增加。四、研究结论:本研究发现,mi R-140-5p促进肾癌增殖和转移的作用是通过KLF9介导的。进而,KLF9通过与下游靶基因KCNQ1的启动子区域特异性结合,进而促进KCNQ1的转录。本研究探讨了mi R-140-5p、KLF9及下游靶基因KCNQ1在肾癌中的生物学功能及其潜在的分子机制,为肾癌发病机制的研究提供了新的线索。