研究目的:本研究拟对28个先天性白内障家系中进行致病突变的筛查。并通过目标基因体外克隆合成、质粒构建、蛋白定位与定量等方法,对检测到的EPHA2受体蛋白基因G668D突变的致病功能进行探索,尝试理解该突变导致先天性白内障发生的机制。研究方法:在浙江大学医学院附属第二医院眼科收集到了 28个先天性白内障家系,抽取各个家系中先证者的外周血样本,提取基因组DNA。通过靶向捕获联合高通量技术在48个先天性白内障候选致病基因中筛选潜在致病突变。结果对比基因组数据库,并使用SIFT、Polyphen、MutationTaster等生物信息学方法分析,以获得疾病候选致病突变。利用PCR联合Sanger测序法在家系中明确与疾病共分离的真正致病突变,并以100名健康中国汉族人DNA样本作为阴性对照进行验证。对EPHA2基因G668D突变所引起的先天性白内障家系中所有家族成员进行眼部裂隙灯检查与全身体格检查,明确疾病表型与遗传模式。为探索EPHA2基因G668D突变引起的功能性改变,我们首先检测了各个配体ephrin在人晶状体上皮前囊膜中的表达情况。我们体外合成了 EPHA2基因cDNA,通过克隆重组与定点突变技术,构建了野生型及突变型的EPHA2过表达GV358质粒与pEGFP-N1 EPHA2-GFP融合蛋白质粒。使用野生型、突变型质粒与空白GV358载体分别转染HLE B3细胞系(人晶状体上皮细胞系),并通过划痕愈合实验检测细胞迁移能力,Hoechst33342检测细胞凋亡情况。使用野生型、突变型质粒和空白pEGFP-N1载体分别转染Hek293T细胞,利用荧光显微镜观察蛋白在细胞中的表达量与细胞中定位。使用免疫印迹法检测野生型与突变型蛋白的表达量,并使用蛋白酶体途径抑制剂MG-132处理细胞,探索突变型蛋白的降解途径。研究结果:利用靶向捕获技术,在28个家系中的14个家系中找到了先天性白内障致病突变,检出率达到50%。此14个突变在家系健康成员与100名健康中国汉族人中均未检测到。其中有10个突变为未曾报道过的新先天性白内障致病突变,4个突变为此前别的研究组报道过的致病突变。眼科检查与体格检查提示,靶向捕获技术捕获到的EPHA2 G668D引起的先天性白内障为常染色体显性遗传的先天性后极性白内障。功能实验提示,ephrin配体在人晶状体上皮前囊膜中高表达。G668D突变引起晶状体上皮细胞系迁移能力增强,对于细胞凋亡无显著性影响。荧光显微镜下EphA2突变蛋白更倾向于形成蛋白聚集,且突变蛋白表达量较野生型蛋白显著降低。蛋白免疫印迹结果提示,突变蛋白在胞内的水平显著降低,但使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理后,突变蛋白水平显著回升。研究结论:靶向捕获联合高通量技术是高效可行的先天性白内障遗传诊断技术,值得在科研及临床中广泛推广。晶状体蛋白基因突变仍是引起先天性白内障的主要致病突变。Eph/ephrin受体配体系统在人晶状体功能与白内障发生中同样发挥重要作用,值得更深入的研究。本研究首次报道的EPHA2激酶区突变G668D可能通过增加细胞的迁移能力,从而导致先天性后极性白内障的发生。且这一迁移力的增加可能由于突变型蛋白更容易被蛋白酶体途径降解,导致突变杂合子晶状体内部的EphA2蛋白含量降低,蛋白单倍剂量不足所致。