药用植物根际土壤稀有放线菌分离方法及多相分类研究

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放线菌是产生生物活性物质最多的一类微生物资源,迄今为止发现的22,500多种微生物活性产物中有70%以上是来自放线菌;已获应用的微生物活性物质不到1%,其中71%是放线菌产生的。因此,从放线菌中寻找新的活性物质是微生物资源开发利用的重要途径。从理论上讲,新物种应该具有新基因,从而合成新的产物。因此发现新菌种正是发现新化合物的必要前提。本研究通过对稀有放线菌分离方法和快速鉴别的研究,发掘新的放线菌资源,为寻找新的活性物质提供物种资源。 从云南昆明、西双版纳等地采集药用植物根际土样,通过比较不同分离培养基、土样预处理、孢子诱导、分散差速离心等方法,开展稀有放线菌分离方法的研究。研究结果表明:海藻糖.无机盐培养基综合分离效果最好,不仅稀有放线菌的出菌率高,而且种类丰富。虽然改良HVG培养基中稀有放线菌出菌率不是最高,但由于培养基中含有吉兰糖胶,对产孢放线菌的生长有促进,分离到了一些特殊类群,如:游动四孢菌属(Planotetraspora)和游动放线菌属(Actinoplanes)。研究发现:用酵母膏+SDS(十二烷基硫酸钠)溶液预处理土样,能促进放线菌孢子的萌发,不仅能有效地抑制了细菌,而且分离到的放线菌类群最丰富。用脱脂牛奶+MOPS(N—吗啉代-丙磺酸)溶液和角蛋白+MOPS溶液预处理土样,虽然出菌率比较低,但分离到了一些稀有的放线菌属如游动放线菌,游动四孢菌等。改良分散差速离心方法研究的结果显示:第二次离心的分离效果佳,其菌落的形态与第一次有明显的不同,稀有放线菌出菌率最高。 利用ARDRA(扩增rDNA限制酶片断长度多态分析)聚类分析法,探索快速鉴别方法,以期快速淘汰重复菌株选出代表菌。研究结果显示,用ARDRA分析法可快速有效地分辨属级差异的菌株,且菌株的颜色与酶切条带没有直接的相关性。 采用多相分类方法,对形态特殊的 YIM 45607,YIM 45681,YIM 45720,YIM 45721,YIM 45762,YIM 45725和YIM 45751等7株稀有放线菌,进行了细胞化学组分、16S rRNA基因序列相似性分析及其基因组DNA-DNA同源性测定等研究,发现5株放线菌新种。菌株YIM 45681为马杜拉放线菌属(Actinomadura)的1个新种,命名为白色马杜拉放线菌(Actinomadura alba sp.nov.):菌株YIM45720为链霉菌属(Streptomyces)的一个新种,命名为慢生链霉菌(Streptomyces serianimatus sp.nov.);菌株YIM 45721为小月菌属(Microlunatus)的一个新种,命名为橙黄色小月菌(Microlunatus aurantiacus sp.nov.);菌株YIM 45725为多态放线菌属(Actinopolymorpha))的一个新种,命名为橙红多态放线菌(Actinopolymorpha rutilus sp.nov.);菌株YIM 45751为斯氏菌属(Stackebrandtia)的一个新种,命名为黄白斯氏菌(Stackebrandtia flavoalba sp.nov.)。
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