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棉花(Gossypium hirsutum)是世界上最重要的经济作物之一,棉纤维作为一种天然纤维为纺织业提供了原材料。棉花纤维细胞是由种皮的最外层细胞分化而来的不分支的单细胞毛状突起,其具有单细胞和线性结构这些特征,因此还为研究植物细胞极性伸长和细胞次生壁合成提供了理想的生物材料。棉花纤维发育可以分为四个明显但又有重叠的阶段:纤维起始、纤维伸长、次生细胞壁合成以及纤维的成熟。长度和强度作为检验棉花纤维品质最重要的衡量标准,绝大多数程度上取决于在纤维伸长阶段的生长速率和模式。因此,研究相关基因在棉纤维细胞的伸长期的分子调控机制是十分必要的。蓝铜蛋白(Bule Copper-binding Proteins,BCPs)是一类小分子可溶性的铜离子结合蛋白,膜联蛋白(Annexins)是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白,两者均广泛存在于植物中,对植物的生长发育起重要作用。我们从陆地棉中分离鉴定了一个编码蓝铜蛋白的基因GhBCP4和一个膜联蛋白基因AnnGh3,这两个基因均在伸长期纤维中优势表达,推测它们在棉纤维伸长发育过程中起重要作用。因此本文以这两个基因为研究对象,利用过量表达、RNA干扰、酵母双杂交等技术对这两个基因的功能、互作蛋白等进行了研究,取得的主要结果如下:1.GhBCP4蛋白亚细胞定位分析取GhBCP4基因ORF构建融合表达载体pBI121::GhBCP4::eGFP,转化棉花,得到大量转基因棉花愈伤组织细胞。将愈伤组织细胞放在荧光显微镜下进行观察,结果在这些细胞中并未发现绿色荧光。分析GhBCP4蛋白结构发现,其N末端有一个信号肽序列,C末端有一个GPI锚定位点,于是将其ORF截短,去掉信号肽及GPI锚定位点后端序列,重新构建融合表达载体转化棉花,结果发现绿色荧光主要分布于液泡中。2.GhBCP4启动子的活性分析根据中国农科院等单位公布的异源四倍体陆地棉全基因组序列,调取了长度为2089bp的GhBCP4启动子序列。通过构建GhBCP4p::GUS融合表达载体并转化拟南芥,得到异源表达的转基因拟南芥植株。逐代筛选最后得到单拷贝纯合体拟南芥株系,对其各时期不同组织进行GUS染色,结果发现在幼苗的根及莲座叶的叶片中有很强的GUS信号,而在成熟时期后的茎生叶、花以及角果中有较弱的表达。而不同激素(生长素、茉莉酸)的处理下会影响GhBCP4启动子活性。这表明GhBCP4可能参与植物生长早期发育,也可能参与一些激素信号通路。3.GhBCP4转基因棉花鉴定及表型分析首先对获得的35S启动子驱动的GhBCP4 RNAi转基因棉花后代(T3代)株系、35S启动子驱动的GhBCP4过量表达转基因棉花后代(T2及T3代)株系、RDL1启动子驱动的GhBCP4 RNAi转基因棉花后代(T2及T3代)株系进行鉴定,然后用qRT-PCR反应检测了GhBCP4基因在这些转基因棉花纤维中的表达量,结果表明在过量表达转基因棉花后代株系的10DPA纤维中GhBCP4基因的表达与野生型相比有着较为明显的上调,而成熟纤维也表现出较野生型更长的特质;而在RNAi株系中GhBCP4基因的表达与野生型相比则呈现不同程度的下调,成熟纤维的伸长也明显受到了抑制。这都表明GhBCP4基因参与调控棉花纤维伸长发育,并且正调控纤维的伸长。4.GhBCP4互作蛋白的筛选鉴定为了进一步分析GhBCP4基因如何在调控棉花纤维伸长发育中发挥作用,可以从与其相互作用的蛋白着手。根据GhBCP4蛋白的结构分析,构建了去掉两端跨膜结构域的信号肽以及GPI锚定位点的pGBKT7-GhBCP4表达融合载体,利用酵母双杂交系统在棉花9DPA纤维cDNA文库中筛选得到互作蛋白,经回转验证表明磷酸己糖异位酶(GhPGM1、GhPGM-LIKE、GhPMM),WD40 重复蛋白(GhWD40R),胚胎特异蛋白(GhATS3)等五种蛋白与GhBCP4有较强的相互作用。分析了这五个靶蛋白基因在棉花各组织的表达模式,结果发现GhPGM1在纤维中优势表达,并在9DPA纤维中表达量达到峰值,这暗示着GhPGM1可能在棉花纤维发育的伸长期起到重要的作用,接着又在GhBCP4转基因株系的10DPA纤维中检测了GhPGM1 的表达变化,结果表明与野生型相比,GhPGM1基因的表达在过量表达株系中上调,在RNAi株系中下调,与GhBCP4的表达变化呈现出一致性,这就表明GhPGM1很有可能与GhBCP4协同参与棉花纤维伸长发育的调控。5.AnnGh3转基因棉花鉴定为探究膜联蛋白基因AnnGh3在纤维发育中的功能,将构建好的AnnGh3过量表达载体 TUA9::AnnGh3 OE 以及 RNAi 载体 TUA9::AnnGh3RNAi GS、TUA9::AnnGh3RNAi C分别转化棉花,获得了大量的转基因小苗,但由于大多数株系的棉花出现生长畸形、不开花或者花粉不育等现象,只得到了少数几个株系正常生长并开花的经鉴定为阳性的转基因棉花植株。由于进一步的实验分析还需得到更多株系的种子,以便在其转基因棉花后代植株中研究AnnGh3基因在棉花纤维伸长中的生物学功能,因此该项实验分析仍在进行中。