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天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)是一种控制生物合成工业中重要天冬氨酸族氨基酸的关键酶,受支路代谢终产物调控。本研究通过改善AK活力,达到解除其在天冬氨酸族氨基酸代谢途径中受代谢产物的反馈抑制,以实现工业中天冬氨酸族氨基酸的高产。具体方法:利用饱和定点突变在已构建的pET-28a-AK基因重组的基础上,对北京棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中AK基因进行空间改造,成功获得高活力突变体,并对其进行功能性分析。结果如下:1.由Blast比对可知,北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)中AK与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中AK序列同源性高达99%。本研究以Cg-AK晶体结构为模板,序列比对找出Cp-AKα亚基调控区域处的保守残基,这些残基通过氢键和范德华力与配体赖氨酸相互作用形成网状结构,具有稳定赖氨酸抑制剂的作用。我们推测,破坏残基与配体赖氨酸间的相互作用,可能在一定程度上解除赖氨酸和苏氨酸在Cp-AK中的协同抑制。根据上述推测,我们通过多重序列比对找到Cp-AKα亚基调控区域相关保守残基M372、G377和V378,并对其进行饱和定点突变,通过高通量筛选获得具有高活力的突变体,分别为M372R、M372G、M372D、M372I、G377D、G377K、G377F、G377Y、V378F、V378D和V378H。将上述突变体转入E.coli(BL21)中异源表达,并经诱导、纯化、10%SDS-PAGE和Western blotting验证结果表明,Cp-AK分子量为48kDa。2.对M372位点四种突变体M372D、M372G、M372I、M372R的AK动力学研究表明:Vmax较WT AK分别提高7.74倍、6.54倍、33.59倍、3.86倍;n值分别为1.1、1.5、1.9和1.6,均低于WT的n值,表明经突变后AK的正协同性降低。突变后Km值较WT AK均有些升高。因此,选择Vmax最大的突变株M372I做酶学性质研究。结果表明:M372I AK最适反应pH为8.0,较WT pH 8.5降低;最适反应温度为30℃,较WT最适温度有提高;在最适条件下的稳定性与WT AK相比提高2.0h;K+在高浓度10mmol/L时对酶有激活作用,其相对酶活为176.8±4.1%,而Mg2+、Mn2+和Fe3+在低浓度为0.2mmol/L时,酶活力提高,其相对酶活分别为154.9±4.3%、132.9±2.5%和117.1±3.6%;除glycerol、iso-Propyl alcohol、acetonitrile和n-butanol浓度为1%时对M372I表现出激活作用外,其它有机溶剂均对M372I AK表现抑制活力的作用。M372I AK中赖氨酸的抑制作用被解除,尤其在低浓度下可促进其活力,甲硫氨酸也在一定程度上对M372I AK活力表现出激活作用。3.对G377位点四种突变体G377D、G377F、G377Y、G377K的AK动力学研究表明:Vmax较WT AK分别提高1.93倍、9.16倍、6.55倍、7.22倍;n值分别为1.1、1.0、1.3和1.3,均低于WT的n值,表明经突变后AK的正协同性降低。突变后Km值较WT AK均有些升高。因此,选择Vmax最大的突变株G377F做酶学性质研究。结果表明:最适反应pH为9.0,较WT pH 8.5提高;最适反应温度为25℃,与WT相同;在最适条件下的稳定性与WT AK相比提高2.6h;K+、Ca2+、Mn2+、Cu2+和Fe3+在低浓度为0.2mmol/L时,对酶有激活作用;除glycerol、iso-Propyl alcohol、acetonitrile和n-butanol浓度为1%时对G377F AK表现出激活作用外,其它有机溶剂均对G377F AK表现抑制活力的作用。赖氨酸对G377F AK的抑制作用被解除,并且在浓度0.2mmol/L和1mmol/L下可促进其活力,其相对活力分别为111.5±1.5%和101.4±0.8%,甲硫氨酸也在一定程度上对G377F AK活力表现出激活作用。4.对V378位点三种突变体V378F、V378D和V378H的AK动力学研究表明:Vmax较WT AK分别提高1.93倍、5.86倍、2.01倍;n值分别为1.0、1.1和1.0,均低于WT的n值,表明经突变后AK的正协同性降低。比较野生型和三种突变体AK的Km值可知,经突变后V378D和V378F使酶与底物的亲和力增强,而V378H使酶与底物亲和力降低。因此,选择Vmax最大的突变株V378F做酶学性质研究。结果表明:最适反应pH为8.0,较WT pH 8.5降低;最适反应温度为28℃,较WT最适温度偏高;在最适条件下的稳定性与WT AK相比提高1.7h;K+、Zn2+、Mn2+、Cu2+和Fe3+在低浓度为0.2mmol/L时,对酶有激活作用;除acetonitrile和n-butanol浓度为1%时对V378F AK表现出激活作用外,其它有机溶剂均对V378F AK表现抑制活力的作用。对比WT发现,只有赖氨酸表现出对V378F AK激活作用,尤其赖氨酸在低浓度(0.2、1mmol/L)时,相对酶活分别为121.5±1.6%、100.4±1.0%。而含有赖氨酸的组合(Thr+Lys及Met+Lys)在低浓度(0.2mmol/L)时,相对酶活分别为117.4±1.3%和122.0±2.0%,均比WT相对提高,说明突变后在一定程度上主要解除了赖氨酸对AK的反馈抑制。