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精原干细胞在经过一系列复杂而又有序的细胞分化过程后最终形成成熟精子,诸多相关研究已经证明精子中不仅存在RNA,精子中基因的表达也会受到相关转录因子的调控。越来越多的与精子发生相关的基因相继被发现,但尚未见到在整个精子发生阶段的基因转录表达研究。本实验室前期对圆形精子细胞、长形精子细胞、成熟精子三种细胞进行了高通量测序,通过DEG-seq软件分析后共筛选到了12105个差异表达基因(P<0.05)。由于基因的差异表达与组织、细胞的生物学性状和功能密切相关,且随着对组织、器官分化及细胞、生物个体生长发育等的深入研究,大量差异转录基因的验证分析变得越来越重要。然而,生殖细胞等样品取样较为困难、精子等RNA含量较少的问题对基因差异表达验证提出了挑战。本试验通过冰冻切片结合激光显微切割技术,在小鼠睾丸组织分别获取了约5×103个圆形精子细胞及长形精子细胞,解决了其它方法(如密度梯度离心法等)无法获取高纯度单一目的细胞、目的细胞获取困难的问题,并成功制备出了纯度高、完整性好的目的细胞RNA。为了验证高通量测序结果的准确性,本试验对12105个差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能分类及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路分析,共筛选出10个位于与精子发生相关的主要通路上的差异表达基因,这10个基因分别为Gabarap、Gkap1、Spaca4、Ndufb8、Atp5g1、Atp5o、Hagh、Tfam、Mbd2、Tbpl1,采用荧光定量PCR(qPCR)方法,以β-actin作为内参基因,对其结果进行了基因差异表达验证。结果显示,其中8个基因的表达水平在圆形及长形精子细胞中要高于成熟精子(P<0.05),与高通量测序结果相符,其余2个基因的表达量在成熟精子中高于长形精子细胞,但差异不显著(P≥0.05),其结果证明,高通量测序结果可靠,具有参考性。