肾上腺髓质素对人牙髓干细胞的调控作用及机制研究

来源 :第三军医大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fogwl
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的当龋病进展侵犯到牙髓时,牙髓可以通过形成修复性牙本质来保护牙髓的健康。DPSCs现在被认为是修复性牙本质形成的一个重要来源,DPSCs具有多向分化的潜能,目前的研究认为成牙本质分化对于牙髓损伤后修复性牙本质的形成起到关键作用。然而目前DPSCs的增殖及分化机制尚未完全确定。研究显示,ADM在牙齿的发育过程中,在关键的发育时间点呈现高表达,并且ADM对成骨现象存在明显的调控作用,而成骨和成牙本质具有很多的相似性。本课题组通过前期检测离体牙牙髓组织的实验发现,相比于正常牙髓,牙髓损伤组织ADM明显呈高表达,并且表达部位集中于损伤牙髓部位和修复性牙本质周围。因此本课题组推测ADM可能对DPSCs的增殖分化具有一定的调节作用。本研究旨在:(一)检测ADM在龋病牙髓组织内的表达情况以及ADM和龋坏程度的相关性。(二)体外分离、培养、鉴定原代DPSCs。(三)通过在DPSCs培养基内加入ADM刺激,研究ADM对DPSCs增殖、凋亡的调控作用以及其作用机制。(四)研究ADM对DPSCs的成牙本质分化的调控作用及其作用机制。方法1.龋坏程度和ADM表达水平的相关性研究收集我院临床拔除的智齿195例,包括龋病95例(根据龋病分类分为浅龋44例、中龋32例、深龋19例)和健康离体牙100例,拔除后立即取出牙髓组织,ELISA检测ADM在牙髓液中的表达水平,免疫组织化学检测ADM在牙髓组织中的表达及细胞定位,利用t检验进行统计学分析。2.DPSCs的培养和鉴定利用临床拔除的健康离体牙的牙髓组织剪碎进行培养,采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液,有限稀释法原代培养。扩大培养细胞至第3代,细胞免疫荧光检测STRO-1/CD146等DPSCs标志物的表达。体外诱导分化后检测ALP活性,矿化结节形成情况,以及DSP表达,明确DPSCs是否具有成牙本质分化的潜能。3.adm对dpscs增殖、凋亡的调控作用及机制研究原代dpscs培养至第3代,加入不同浓度adm干预后,通过流式细胞检测细胞周期及细胞凋亡情况,通过westernblot检测凋亡蛋白的表达,观察adm对于dpscs增殖能力的影响。通过westernblot检测调控细胞增殖关键信号通路蛋白jnk/c-jun的表达和磷酸化水平,以及调控细胞凋亡关键信号通路蛋白src/gsk-3β的表达和磷酸化水平。此外通过adm及jnk/c-jun通路抑制剂sp600125共处理,以及adm与src/gsk-3β通路抑制剂pp2共处理,探讨adm是否通过激活src/gsk-3β通路及src/gsk-3β通路分别调控dpscs增殖及凋亡的。4.adm对dpscs成牙本质分化的作用及机制研究原代dpscs培养至第3代,加入adm(10-8mol/l)处理24小时,通过westernblot检测成牙本质分化相关标志蛋白的表达,同时检测creb及磷酸化creb、bmp2表达水平。通过荧光素酶活性报告实验以及chip检测creb对于bmp2的转录结合位点。此外,在adm处理细胞同时加入h89抑制creb磷酸化,或在adm处理细胞同时加入noggin抑制bmp通路,观察adm是否通过激活creb/bmp通路进而促进dpscs成牙本质分化。结果1.龋病和adm表达水平的相关性研究elisa检测结果显示:龋坏组的牙髓组织液中adm水平显著高于健康组,此外发现,在深龋组、中龋组、浅龋组的牙髓组织液中深龋组adm水平显著高于中龋组和浅龋组,中龋病人adm水平显著高于浅龋组。通过免疫组织化学检测发现adm在龋坏相邻的牙髓范围内染色显示高表达,并且在修复性牙本质周围更为显著。2.dpscs的培养和鉴定7天后少数细胞增殖能力旺盛形成克隆,细胞呈stro-1及cd146阳性。矿化诱导培养后,细胞可形成矿化结节,alp活性显著升高,westernblot检测显示细胞表达dsp蛋白。3.adm对dpscs增殖、凋亡的调控作用及机制研究10-7m-10-10madm处理细胞后24hr,adm处理组g2/s/m期细胞比例显著上升而细胞倍增时间显著低于空白对照组,其中10-7m及10-8madm处理组无显著差异,但促进dpscs增殖的作用显著高于其他2组。10-8madm处理后,dpscs中jnk/c-jun蛋白磷酸化水平明显增加,10-8madm联合10μmsp600125处理后,jnk/c-jun磷酸化水平降低,细胞增殖能力显著下降。10-7m-10-10madm处理细胞后24hr,adm处理组细胞凋亡率及caspase3表达水平显著下降,其中10-7M及10-8M ADM处理组之间无显著差异,但抑制DPSCs凋亡的作用显著高于其他2组。10-8M ADM处理后,DPSCs中Src/GSK-3β蛋白磷酸化水平显著增加,10-8M ADM联合20μM PP2处理DPSCs,Src/GSK-3β磷酸化水平降低,细胞凋亡率显著上升。4.ADM对DPSCs成牙本质分化的作用及机制研究10-7 M ADM处理DPSCs后,Alizarin red S染色水平显著高于对照组。Western blot检测结果显示,ADM处理组RUNX2/ALP/OCN蛋白表达水平均显著高于对照组。此外,ADM处理组p CREB表达水平较对照组显著上升,但细胞总CREB水平未见显著变化。定量PCR和Western blot结果显示ADM处理组BMP2 mRNA和蛋白表达水平均较对照组显著上升。荧光素酶活性报告及ChIP结果显示CREB可通过结合BMP2启动子-1094至-669区域促进BMP2的转录。10-7 M ADM/5μM H89共处理后p CREB/BMP2/RUNX2/ALP/OCN表达水平均显著低于单独ADM处理,而10-7 M ADM/100ng mL Noggin共处理后RUNX2/ALP/OCN表达水平均显著低于单独ADM处理。结论1.ADM在龋病牙髓组织高表达,并且与龋病的进展呈现正相关。2.从成体人牙髓组织中可分离培养出DPSCs,具有成牙本质分化能力。3.ADM通过激活JNK/c-Jun信号通路促进DPSCs的增殖,通过激活Src/GSK-3β信号通路抑制DPSCs凋亡。4.ADM通过促CREB磷酸化进而上调BMP转录表达的途径促进DPSCs成牙本质分化。
其他文献
本文从“术、数、束”三个维度,总结企业新型学徒制实施的关键要素,提出了企业新型学徒制可持续实施的关注点。
基于人际网络具有小世界性的研究,国内外学者利用小世界网络对知识交流活动进行了大量研究。而研发人员的知识交流网络有别于人际交流网络,具有其自身的特性,该网络是否也具
绩效管理是创新政府管理方式的重要举措,税务部门作为国家重要经济管理和税收执法部门,实施绩效管理,是适应政府管理改革大势的迫切需要,也是服务经济社会发展大局的内在要求
"民间文学概论"作为一种系统性、理论性和整体性的课程体系话语,它是对于"民间文学"进行言说和体认的特殊知识传承方式和知识生产途径。纵观该课程的发展历程,其呈现出的课程
大家都知道,以往“严师出高徒”的信条,“权威论”的古训,已经不适应当前的教育形势了。本文主要讲述了在现代教育教学工作中,教师对学生的微笑是对学生一种无声的关爱和激励
近年来,随着深化征管改革的逐步推进,地税工作的内容、流程、机制、重心已悄然发生了改变,干部队伍在思想观念、履职意识等方面出现了与形势发展不相适应的一系列问题,“不求
当前,我国教育改革步入"深水区",高等教育领域"双一流"建设启动,高校改革发展面临机遇的同时也蕴藏着挑战。高校统一战线工作是中国共产党统一战线工作的重要组成部分,充分发
本统计期(2018年5月17日—2018年5月23日)行情总体呈现反弹走势,两融余额同样上升,期末报收于9969.08亿元,比上期末上升93.35亿元,本周有望冲击万亿大关。从行业的角度看,28个
市场方面,中信证券认为A股处于预期重构期中,不确定性因素较多,又恰逢财报披露高峰;3月建议细选主线,看短做短,业绩为王。与2017年极致稳定的低波动不同,2018年内外盘多因素扰动下,A
本文从网络的角度,研究了图书馆这样一种有趣的复杂系统.读者和图书之间通过借阅建立联系,可以在两个层次上用网络语言来描述,即二元(读者-图书)和单元(读者-读者,图书-图书)