近年来发现阴沟肠杆菌能引起包括呼吸道感染、泌尿生殖道感染、皮肤软组织感染以及血流感染在内的各种感染,已成为医院感染重要的病原菌。比较上海地区细菌耐药性监测资料,显示本院的肠杆菌属细菌对包括β-内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类等临床常用的3类抗菌药物的耐药性问题更为突出。据文献报道,肠杆菌科细菌对上述临床常用的3种抗菌药物的耐药机制研究显示：1.产生ESBLs及AmpC酶是该菌对β-内酰胺类抗生素耐药的重要机制,而编码产ESBLs及AmpC酶的基因大多由质粒介导；2.对氨基糖苷类耐药主要因产aac(3)-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,aac(6’)-Ⅰ、Ⅱ等基因介导的氨基糖苷类钝化酶以及产由rmtB、armA等基因介导的氨基糖苷类甲基化酶所致,以上基因亦通常位于质粒上；3.近年发现的质粒qnr基因可介导喹诺酮类耐药。据文献报道①大多数失活酶和钝化酶的编码基因均由质粒介导。质粒介导产生的酶大多为结构型、固有的,不需要诱导剂即可大量产生,这些酶对p-内酰胺类、氨基糖苷类等相应抗菌药物行水解或修饰钝化作用,造成细菌对抗菌药物高水平耐药；②同一耐药质粒上常同时携带β一内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类以及磺胺药、季胺类消毒剂等多种耐药基因,故可引起细菌对多种抗菌药物同时耐药；③质粒介导的耐药基因可随着质粒在肠杆菌科细菌的种和属之间广泛传播,故质粒介导的耐药性在临床上具有十分重要的意义。本课题的前期研究发现临床分离阴沟肠杆菌的PFGE谱显示无明显的流行克隆但其耐药谱竟如此相同,提示这些菌株中可能携带有相同或相似的耐药质粒。因此有必要对阴沟肠杆菌质粒介导的耐药机制进行深入的研究。本课题对本院2005年临床分离的101株阴沟肠杆菌进行了研究,研究了这些菌株对临床常用抗菌药物的耐药性、同源性,检测了以上菌株对临床上常用的3类抗菌药物质粒介导的耐药基因,并对临床菌株进行了质粒的转移接合试验,检测了质粒所携带的耐药基因和基因的结构。第一部分阴沟肠杆菌的药物敏感性试验及同源性分析采用琼脂对倍稀释法测定了头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、阿米卡星等13种抗菌药物对101株临床分离的阴沟肠杆菌的最低抑菌浓度。结果显示本组101株阴沟肠杆菌对头孢噻肟和头孢他啶的耐药率分别为53.4%和51.4%,但对头孢吡肟较为敏感,细菌耐药率为10.9%。本组资料同时显示该菌对酶抑制剂复方制剂头孢哌酮／舒巴坦和哌拉西林／三唑巴坦十分敏感,细菌耐药率均为16.9%。碳青霉稀类抗生素的抗菌活性最强,细菌敏感率为100%。该菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为35.6%和31.7%；对阿米卡星的耐药率较低为19.8%,但对庆大霉素耐药率为41.6%。本组细菌耐药谱显示101株阴沟肠杆菌中对第三代头孢菌素耐药同时对喹诺酮类或氨基糖苷类耐药的菌株为30株(29.7%,30/101),对第三代头孢菌素、喹诺酮类和氨基糖苷均耐药的菌株为22株(21.8%,22/101)。101株阴沟肠杆菌的PFGE分型结果显示本组细菌同源菌株很少,仅有3组共7株细菌分别属同一克隆株,余94株细菌PFGE图谱均不相同,提示在本院范围内无阴沟肠杆菌同一克隆株的流行,但以上不同克隆株经常表现出相同或相似的耐药谱型,提示这些不同的菌株内可能携带相同或相似的耐药质粒。第二部分阴沟肠杆菌质粒介导耐药基因的分子生物学研究本部分研究采用酚／氯仿法对101株临床分离阴沟肠杆菌进行质粒DNA抽提后,经PCR方法扩增检测质粒介导的ESBLs和AmpC酶基因,氨基糖苷类钝化酶和氨基糖苷类甲基化酶基因,以及质粒介导喹诺酮类耐药的三种主要基因。1.质粒介导的ESBLs和AmpC酶基因检测采用酚／氯仿法制备阴沟肠杆菌质粒DNA模板,运用TEM型、SHV型、CTX-M型引物以及质粒介导AmpC酶的6对引物MOX、CIT、DHA、ACC、EBC、FOX等对101株阴沟肠杆菌进行PCR扩增并测序结果显示72株(71.3%,72/101)含有质粒介导β-内酰胺酶,其中37株(36.6%,37/101)菌株含有TEM-1型β-内酰胺酶基因,54株(53.5%,54/101)携带SHV-12型ESBLs,31株(30.7%,31/101)含CTX-M型ESBLs基因。18株(17.8%,18/101)含DHA-1型AmpC酶。上述72株菌株中仅含TEM-1型基因或仅含DHA-1型AmpC酶基因各1株,余70株(69.3%,70/101)均为产ESBLs菌株,其中46株(45.5%,46/101)含两种或两种以上β-内酰胺酶基因。2.质粒介导的喹诺酮耐药基因检测本研究以细菌质粒DNA为模板,运用qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac(6’)-Ib及qepA基因引物,对101株阴沟肠杆菌采用PCR方法进行了扩增,并对qnr基因进行了测序分型；同时检测了染色体介导的DNA旋转酶及拓扑异构酶IV的gyrA和parC基因突变和相应氨基酸突变。结果显示101株阴沟肠杆菌中共有39株细菌为qnr基因阳性(38.6%,39/101),其中19株(18.8%,19/101)细菌为qnrA基因阳性；18株(17.8%,18/101)细菌为qnrB基因阳性；3株(3.0%,3/101)细菌为qnrS基因阳性。其中1株细菌同时携带qnrB及qnrS两种基因。101株阴沟肠杆菌中未检测出qnrC及qnrD基因。所有qnr基因阳性菌株的扩增产物均经测序并与GenBank上基因序列进行比对,结果显示19株qnrA基因阳性菌株均为qnrAl亚型,18株qnrB基因阳性菌株中有16株为qnrB4亚型,1株为qnrB6亚型,1株为qnrB10亚型；3株qnrS基因阳性菌株中1株为qnrSl亚型,1株为qnrS2亚型,另有1株菌株同时含有qnrB4和qnrSl两种qnr基因。101株阴沟肠杆菌中有44株细菌采用PCR方法扩增到aac(6’)-Ib基因的扩增产物。该44株细菌的aac(6’)-Ib基因的扩增产物经FokI酶切后其中7株细菌因缺乏GGATG位点,无法切开,此7株(6.9%,7/101)同时经序列测定确证为aac(6’)-Ib基因突变株-aac(6’)-Ib-cr菌株,其中4株同时携带qnrB4基因,余37株FokI酶切均可切开,为aac(6’)-Ib野生型菌株。101株阴沟肠杆菌中未扩增到qepA基因。对39株qnr基因阳性的菌株采用PCR方法扩增了gyrA和parC基因的喹诺酮类耐药决定区域(QRDR),并对其扩增产物进行了测序。与Genbank进行了比对,结果显示有23株qnr基因检测阳性的菌株GyrA和ParC QRDR区域氨基酸无突变,该类菌株均为环丙沙星敏感株(按CLSI2006年标准)。一株细菌的GyrA QRDR区域83位Ser突变为Tyr,该菌株为环丙沙星中敏株。另外在15株qnr基因检测阳性发现QRDR区域发生1-3个位点突变,包括GyrA QRDR区域83位Ser(丝氨酸)突变为Ile(异亮氨酸)或Phe(苯丙氨酸)或Leu(亮氨酸)及87位Asp(天冬氨酸)突变为Ala(丙氨酸),ParC QRDR区域80位Ser(丝氨酸)突变为I1e(异亮氨酸),该类菌株均为环丙沙星耐药株。101株阴沟肠杆菌中有36株环丙沙星耐药株,其中含qnr基因阳性的菌株为15株,阳性检出率为41.7%(15/36)；在63株环丙沙星敏感菌株中qnr基因阳性菌株23株,阳性率为36.5%(23/63)。两组细菌qnr基因阳性率经卡方检验,差异无统计学意义(P＝0.23),提示在喹诺酮耐药或不耐药的两组菌株中qnr基因检出率相仿。本研究39株qnr阳性菌株中有23株细菌对环丙沙星敏感,这些菌株的GyrA和ParC QRDR区域无氨基酸突变,其环丙沙星的MIC值为0.06mag/L-1mag/L。与野生株相比(通常野生株对环丙沙星的MIC≤0.015mg／L),MIC值明显降低。提示这些细菌对喹诺酮类敏感性的下降可能仅由qnr所致,推测qnr也可能是细菌在对喹诺酮类耐药性形成过程中最早出现的耐药机制。101中株阴沟肠杆菌中70株细菌含有ESBLs酶基因,其中35株(50%,35/70)qnr基因阳性,而31株非产ESBLs菌株中仅4株(12.9%,4/31)细菌为qnr基因阳性,两组细菌的qnr基因检测阳性率经卡方检验差异具有统计学意义(P=0.005)。在18株质粒介导AmpC酶阳性菌株中14株(77.8%,14/18)细菌出现qnr基因阳性,而83株非产AmpC酶菌株中有25株(30.1%,25/83)细菌qnr基因阳性,两组细菌的qnr基因检测阳性率经卡方检验同样具有统计学意义(P=0.018),上述结果提示产ESBLs或者质粒介导AmpC酶的菌株较非产酶株更易同时携带qnr基因。3.质粒介导氨基糖苷类钝化酶和氨基糖苷类甲基化酶检测。本研究应用aac(3)-I、aac(3)-II、aac(3)-III、aac(6’)-Ib、aac(6’)-II、ant(2")-I、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅵ等8种氨基糖苷类钝化酶基因和armA及rmtB2种氨基糖苷类甲基化酶基因引物对101株阴沟肠杆菌进行了PCR扩增,结果显示48株(47.5%,48/101)被检测出含有氨基糖苷类钝化酶基因；13株(12.9%,13/101)细菌含有armA或rmtB甲基化酶基因,其中10株(9.9%,10/101)同时检测出含氨基糖苷类钝化酶和氨基糖苷类甲基化酶基因。48株氨基糖苷类钝化酶基因阳性的菌株中有44株(43.5%,44/101)菌株被检测出含有aac(6’)-Ib基因,其中有7株为aac(6’)-Ib-Cr(aac(6’)-Ib基因突变株)；22株(21.8%,22/101)含ant(2”,)-Ⅰ基因；6株(5.9%,6/101)含aac(3)-Ⅱ基因；1株(1.0%,1/101)含aac(3)-Ⅰ基因；2株(2.0%,2/101)含ant(3”)-Ⅰ基因。而aac(3)-Ⅲ、aac(6’)-Ⅰ和aph(3’)-Ⅵ等3种氨基糖苷类钝化酶基因在本组101株阴沟肠杆菌中均未检出。在13株(12.9%,13/101)被检测为含有armA或rmtB氨基糖苷类甲基化酶基因的菌株中含armA基因为12株(11.9%,12／101),含rmtB基因为2株(2.0%,2/101)。其中1株同时含有armA和rmtB基因。13株含氨基糖苷类甲基化酶菌株均表现为对阿米卡星和庆大霉素高度耐药,上述两种抗生素的MIC值均>256mg/L。在含氨基糖苷类钝化酶基因的菌株中呈现对氨基糖苷类不同的耐药水平。如含单一aac(6’)-Ib基因的菌株中表现为庆大霉素MIC值从4mg/L到>256mg/L不等。在101株阴沟肠杆菌中共有70株(70.3%)含有ESBLs酶的细菌中,有47株(67.1%,47/70)细菌呈现氨基糖苷类钝化酶基因阳性,而31株非产ESBLs菌株中仅1株(3.3%,1/31)细菌为氨基糖苷类钝化酶基因阳性,两组细菌的氨基糖苷类钝化酶基因检出阳性率经卡方检验差异具有统计学意义(P=0.0001)。70株ESBLs阳性菌株中有13株(18.6%,13/70)细菌含氨基糖苷类甲基化酶基因,另外31株非产ESBLs菌株均未检测到含氨基糖苷类甲基化酶基因菌株,两组细菌的氨基糖苷类甲基化酶基因检出阳性率经卡方检验差异具有统计学意义(P=0.005)。上述结果显示产ESBLs菌株中产氨基糖苷类钝化酶和氨基糖苷类甲基化酶检出率明显高于非产ESBLs酶菌株,提示在产ESBLs酶菌株中易同时携带有氨基糖苷类钝化酶基因和氨基糖苷类甲基化酶基因。第三部分阴沟肠杆菌耐药质粒的接合转移为了解上述101株阴沟肠杆菌中耐药质粒的可转移性,选择①44株同时含有ESBLs(SHV-12型及CTX-M型)及DHA-1型AmpC酶基因的菌株；②12株同时含SHV-12型ESBLs.DHA-1型AmpC.qnr.aae(6’)-Ib基因4种基因的临床菌株作为供体菌,对大肠埃希菌J53AZR进行质粒转移接合试验。44株同时含有ESBLs及AmpC酶基因的菌株中有30株细菌发生了转移接合,耐药质粒的转移接合发生率为70.5%(30/44)。经对接合子的质粒抽提结果显示7株接合子与供体细菌一样均只携带1个质粒。对这7株接合子进一步研究显示①供体菌E-41×J53AZR→接合子41TC发生了CTX-M-1G基因的转移接合；②供体菌E-57×J53 AZR→接合子57TC和供体菌E-70×J53 AZR→70TC发生了CTX-M-9G和aac (6’)-Ib基因的转移接合；③供体菌E-91×J53AZR→接合子91TC和供体菌E-95×J53AZR→95TC发生了qnrB、SHV-12、DHA-1和aac(6’)-Ib基因的转移接合；④供体菌E-206×J53AZR→接合子206TC和供体菌E-209×J53AZR→209TC发生了CTX-M-9G和aac(6’,)-Ib基因的转移接合。转移接合的结果提示①以上CTX-M-1G、CTX-M-3G、CTX-M-9G、SHV-12型ESBLs及DHA-1型AmpC均具有可接合性。②依据7株接合子菌株均含有1个质粒,故提示CTX-M-3G型和aac(6’)-Ib基因、CTX-M-9G和aac(6’)-Ib、SHV-12和aac(6’)-Ib基因可能位于同一质粒上,发生共同转移接合。7株接合子的头孢噻肟和头孢他啶的MIC值在4-32mg/L,与供体菌接近,较受体菌J53AZR(MIC值为≤0.06mag/L)升高66.7-533倍,庆大霉素和阿米卡星的MIC值在4-128mg/L(除1株41TC庆大霉素MIC为0.5mg/L),较受体菌J53AZR(庆大霉素MIC值为0.125mg/L)升高16-1024倍。12株同时含有qnrB, SHV-12、DHA-1和aac (6’)-Ib基因的临床菌株行转移接合试验后有7株细菌发生了转移接合,耐药质粒的转移接合发生率为58.8%(7/12)。经对接合子的质粒抽提结果显示：7株供体菌基因型类似,均含有SHV-12、DHA-1、qnrB4、aac(6’)-Ib、ant (2")-I基因,发生了SHV-12、DHA-1、qnrB4,aac(6’)-Ib基因的转移接合,接合子的环丙沙星MIC值比受体菌J53AZR高12-24倍,为0.094 mg/L-0.19mg/L,而受体菌的MIC值仅为0.008mg/L。这一结果同样提示接合子对喹诺酮类敏感性的下降仅由qnrB基因所致,推测qnr可能是细菌对喹诺酮类耐药性形成过程中最早出现的耐药耐药机制。7株接合子的三代头孢菌素的MIC值与供体菌接近,但较头孢噻肟或头孢他啶对受体菌J53AZR(≤0.06 mg／L)的MIC值上升了66.7-1000倍,达到4 mg/L-64mg/L,对氨基糖苷类抗菌药物庆大霉素和阿米卡星均较受体菌J53AZR(0.125 mg/L～0.25mg/L)的MIC上升了16-1024倍,达到2 mg/L-128mg/L。第四部分阴沟肠杆菌多重耐药质粒的基因结构分析对上述研究获得的7株含qnrB基因、SHV-12. DHA-1及aac(6’)-Ib基因的转移接合子进行耐药质粒的基因结构及基因周边结构的进一步研究结果显示：经HindⅢ酶切、与载体PUC18连接,再经酶切验证发现一段约14kb的片段连接入载体PUC18中。对其中2株接合子质粒65TC和404TC的14kb片段进行了测序结果显示2个接合子的DNA周边结构相同,且与本研究所前期报道的肺炎克雷伯中含qnrB4基因质粒pSH7结构相仿,包含有sapA-qnrB4-pspF-pspA-pspB-pspC-pspD-orfl-基因序列。qnrB4基因上游为sapA基因,推测其编码一个肽转运系统酶。pspF-pspA-pspB-pspC-pspD为psp操纵子,编码一个噬菌体休克蛋白,其后为orfl读码框,之后为编码AmpC酶的blaDHA-1基因及ampC的调控基因ampR。此外采用PCR检测发现以上7株接合子及其供体菌均含有qac△l-sull耐消毒剂和磺胺基因、整合子遗传标记Integrase I(整合酶基因)、Tn21／Tn501转座子遗传标记(汞离子还原酶基因)基因,提示以上7株接合子除对三代头孢菌素、氨基糖苷类耐药外,还对季胺类消毒剂和磺胺耐药,系多重耐药质粒,故以上7株接合子含有qnrB4基因、SHV-12、DHA-1、aac(6’)-Ib以及qac△l-sull耐消毒剂和磺胺基因、整合子遗传标记Integrase I(整合酶基因)、Tn21／Tn501转座子遗传标记(汞离子还原酶基因)基因,在阴沟肠杆菌中发现含有以上多种耐药基因的质粒尚属首次报道。7株转移接合子中SHV-12、aac (6’)-Ib等基因位于质粒的哪个区域还有待进一步的研究。