【摘 要】
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目的:罗氟司特作为第一个正式应用于临床治疗的磷酸二酯酶4抑制剂,对慢性阻塞性肺疾病的治疗有积极作用。从药理作用来看,罗氟司特能够抑制细胞内磷酸二酯酶4的活性,从而增加细胞内第二信使cAMP的含量,进而发挥包括抗炎作用在内的一系列生物学功能。最新的研究发现罗氟司特能够降低伴有糖尿病的COPD患者的空腹血糖和糖化血红蛋白水平,并减轻患者体重,可以更好的维持体内葡萄糖的稳态。进一步的研究提示罗氟司特可能
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目“AT1受体介导的胰岛素分泌特点及机制研究”（编号:81670710）； 国家自然科学基金面上项目“VIP及受体VPAC2精细调控胰岛素分泌的作用特点及机制研究”（编号:81770776）； 国家自然科学基金面上项目“KV通道介导罗氟司特促进胰岛素分泌和抑制β细胞凋亡双重效应及其机制研究”（编号:81973
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目的:罗氟司特作为第一个正式应用于临床治疗的磷酸二酯酶4抑制剂,对慢性阻塞性肺疾病的治疗有积极作用。从药理作用来看,罗氟司特能够抑制细胞内磷酸二酯酶4的活性,从而增加细胞内第二信使cAMP的含量,进而发挥包括抗炎作用在内的一系列生物学功能。最新的研究发现罗氟司特能够降低伴有糖尿病的COPD患者的空腹血糖和糖化血红蛋白水平,并减轻患者体重,可以更好的维持体内葡萄糖的稳态。进一步的研究提示罗氟司特可能通过增加血浆GLP-1而促进胰岛素分泌。基于以上的研究背景,我们考虑到一方面细胞内cAMP浓度的改变可能会明显影响机体胰岛素的产生,而罗氟司特能够增加细胞内cAMP含量,另一方面胰岛β细胞作为一种电兴奋细胞,其分泌胰岛素的功能与细胞膜离子通道的兴奋性有密切关系,因此,本课题着重探索了罗氟司特对胰岛β细胞电生理学和胰岛素分泌的影响,以及对胰岛β细胞生存、增殖的影响,进一步探讨了发挥这些效应可能的信号转导通路和调控机制,为罗氟司特可能有效的预防和治疗糖尿病提供理论依据和实验支持。方法:1.大鼠胰岛组织和β细胞的分离和培养。分离大鼠胰腺组织后给予胶原酶P在37℃水浴中消化大鼠的胰腺,并以密度梯度离心法获得大鼠胰岛,并进一步消化分离为胰岛β细胞,用于进一步的实验。2.通过胰岛素分泌实验观察罗氟司特对大鼠胰岛组织的胰岛素分泌的影响。分别给予不同浓度和剂量的葡萄糖和罗氟司特进行干预,观察其对胰岛素分泌的影响。3.通过全细胞膜片钳实验探讨罗氟司特对β细胞动作电位、电压依赖性钾通道、电压依赖性钙通道的通道电流的影响。应用全细胞膜片钳技术,观察给予不同浓度的罗氟司特和特异性信号通路阻断剂应用后对β细胞动作电位、电压依赖性钾通道、电压依赖性钙通道的影响。4.应用Ca2+特异的荧光染料Fluo-4AM孵育胰岛β细胞,通过酶标仪检测罗氟司特对β细胞的特异性荧光强度的影响,反映了罗氟司特对细胞内钙离子浓度变化的影响以及引起这种变化的相关信号转导机制。5.应用CCK-8法检测了罗氟司特对高糖高脂以及毒胡萝卜素诱导的胰岛INS-1细胞和CHO-Kv2.1细胞增殖生存的影响,并探讨了罗氟司特影响β细胞增殖、生存的可能机制。6.应用C57BL/6小鼠和db/db糖尿病模型小鼠的胰岛β细胞,探讨了罗氟司特对整体动物状态下胰岛素分泌以及病理状态下电压依赖性钾通道等电生理学变化的影响。结果:1.在低葡萄糖浓度（2.8mmol/L）条件下,不同剂量的罗氟司特（100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L）均没有明显影响胰岛素分泌,而在较高葡萄糖（8.3m M）情况下,罗氟司特（200nmol/L、300nmol/L）明显地促进了大鼠胰岛的胰岛素分泌。表明罗氟司特能剂量依赖性的促进大鼠胰岛的胰岛素分泌。2.在低葡萄糖（2.8 mmol/L）条件下,罗氟司特（200nmol/L）没有明显地影响胰岛素分泌,而在较高葡萄糖（8.3mmol/L）和高葡萄糖（16.7mmol/L）的情况下,罗氟司特（200nmol/L）均明显地促进了大鼠胰岛的胰岛素分泌。表明罗氟司特能葡萄糖浓度依赖性的促进胰岛素分泌。3.罗氟司特抑制了胰岛β细胞的电压依赖性钾（Kv）通道,并延长了β细胞的动作电位时程（APD）。4.罗氟司特增加了β细胞内的钙离子浓度,但是并没有明显激活β细胞的电压依赖性钙通道（VDCC）。5.Kv通道在罗氟司特调控的大鼠胰岛素分泌中发挥了重要作用。6.通过应用CHO-Kv2.1细胞,发现罗氟司特并不是直接抑制Kv通道。7.罗氟司特通过AC/cAMP/Epac信号转导通路抑制了Kv通道电流,并促进了胰岛素的分泌。8.罗氟司特通过抑制Kv通道,延长动作电位时程而增加了细胞内Ca2+浓度。9.罗氟司特能够改善高糖高脂诱导INS-1细胞的细胞活力,发挥对INS-1细胞的保护作用。10.罗氟司特通过抑制Kv通道发挥了改善高糖高脂和毒胡萝卜素（Thapsigargin）诱导的INS-1细胞的细胞活力,发挥对INS-1细胞的保护作用。11.罗氟司特不能改善高糖高脂诱导CHO-Kv2.1细胞的细胞活力,对CHO-Kv2.1细胞的保护作用不明显。12.罗氟司特能够增加C57BL/6小鼠的血胰岛素水平,进而降低了C57BL/6小鼠的血葡萄糖水平。13.罗氟司特能够抑制db/db糖尿病小鼠的电压依赖性钾通道,并促进db/db糖尿病小鼠的胰岛素分泌。结论:1.罗氟司特能够剂量依赖性和葡萄糖依赖性的促进大鼠的胰岛素分泌。2.罗氟司特通过AC/cAMP/Epac信号通路抑制了Kv通道,最终促进了胰岛素分泌。3.罗氟司特没有影响电压依赖性钙离子通道,而是通过抑制电压依赖性钾通道,延长了动作电位时程,增加了细胞内钙离子浓度,最终促进了胰岛素的分泌。4.罗氟司特能够改善高糖高脂和毒胡萝卜素诱导的INS-1细胞的细胞活力,具有对胰岛β细胞的保护作用。5.罗氟司特能够改善C57BL/6小鼠的葡萄糖代谢,也促进了db/db糖尿病小鼠的胰岛β细胞的胰岛素分泌。
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