【摘 要】
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目的:骨缺损的治疗周期漫长,至少需要经历3个月才能形成较为成熟的骨组织,在其愈合修复过程中,血管生成先于骨形成,血管的早期形成对后期成骨分化起着至关重要的作用。在目前的临床治疗中,通过促进早期血管生成,加快骨组织的再生速度,已经得到很多研究学者的认同。本研究的目的是将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）和丝素蛋白（silk fibroin,
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目的:骨缺损的治疗周期漫长,至少需要经历3个月才能形成较为成熟的骨组织,在其愈合修复过程中,血管生成先于骨形成,血管的早期形成对后期成骨分化起着至关重要的作用。在目前的临床治疗中,通过促进早期血管生成,加快骨组织的再生速度,已经得到很多研究学者的认同。本研究的目的是将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid）,PLGA）和丝素蛋白（silk fibroin,SF）两种高分子聚合物通过同轴静电喷雾法制备成具有核壳结构的微球,这种药物递送系统结合骨缺损的治疗模式,将促血管生成药物川芎嗪和促成骨生成的药物淫羊藿苷分别包封于微球的壳层和核层,通过依次释放川芎嗪和淫羊藿苷,增加促血管生成药物和促骨形成药物在局部的累积量,促进骨缺损部位早期成血管,后期成骨,从而达到治疗目的。方法:本研究将PLGA和SF分别溶于六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol,HFIP）有机溶剂用作壳层溶液和核层溶液,通过同轴静电喷雾法制备SF/PLGA核壳微球,在制备过程中采用单因素控制变量法找到最优制备参数。将川芎嗪和淫羊藿苷两种药物分别加入壳层溶液和核层溶液,在最优制备参数下制备成可促血管和骨生成的核壳载药微球,用扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）及激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）对微球的形貌和核壳结构进行表征,对其物理性能、载药性能、体外降解规律及释药规律等进行了探究,并用CCK-8法通过对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）和脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）进行细胞增殖-毒性检测,来评估空载微球和载药微球的细胞相容性。结果:1、本研究通过探索静电喷雾法制备过程中的各种参数对微球形貌的影响,得到制备该核壳微球PLGA和SF溶液最优浓度配比为4%（w/v）:1%（w/v）,最优工艺参数为:接收距离20 cm、外加电压12.5 k V,壳层流速1 m L/h,核层流速0.1m L/h。用SEM进行表征,发现在此条件下制备出的空载核壳微球和载药核壳微球均表面光滑,粒径较为均一并具有良好的单分散性。用LSCM进行表征,间接证明了微球核壳结构的存在。2、对空载微球和载药微球的接触角进行测量:测量结果分别为（124.5±1.49）°和（78.24±3.94）°,与空载微球相比,载药微球接触角减小,两组微球的接触角差别具有统计学意义（P＜0.05）。对空载微球和载药微球吸水率进行计算:结果分别为（87.30±5.51）%和（112.87±6.82）%,载药微球的吸水率高于空载微球,两组微球的吸水率有统计学差异（P＜0.05）。核壳载药微球中川芎嗪的包封率和载药率分别为（45.3±3.13）%和（0.314±5.62）%;淫羊藿苷的包封率分别为（65.5±2.67）%和（0.13±4.47）%。3、体外降解实验结果显示:降解初期,微球基质吸水发生溶胀,壳层表面开始出现孔洞并扩大连成片,疏松多孔的核层暴露出来,并逐渐塌陷碎裂,变成小块状和粉末,直至完全消失。4、体外释药实验结果表明:载药微球释药性能稳定,随着核壳层SF和PLGA的逐步降解,能够实现壳层负载的川芎嗪,核层负载的淫羊藿苷序贯递次释放。在为期三个月的释药实验中,壳层川芎嗪药物释放量达到了90%,核层淫羊藿苷释放量达80%,且药物的释放仍在进行中。5、体外细胞实验表明:在5天的培养中,载药微球组的细胞增殖率均高于空载微球组,由于载药微球壳层负载的促血管生成药物在早期释放,因此脐静脉内皮细胞组的增殖效果明显于骨髓间充质细胞组（P＜0.05）,空载微球组与空白对照组间细胞增殖情况无明显差异,表明微球无细胞毒性,不会对细胞增殖产生抑制作用（P＞0.05）,空载核壳微球和载药核壳微球都具有良好的细胞相容性。结论:综上,本研究采用同轴静电喷雾法制备出表面圆整光滑,粒径分散均一的SF/PLGA核壳微球,并探索得到其最优制备参数;结合骨缺损的治疗模式,本研究成功构建出壳层载有川芎嗪,核层载有淫羊藿苷的核壳微球药物递送系统,与空载微球相比,药物的加入改变了其亲水性;在体外实验中,这种具有高药物包封率和载药率的载药微球,表现出长达三个月的药物缓慢释放能力,并具有良好的生物降解性和细胞相容性。因此,研究并制备这种具有双重阶梯释放的药物递送系统在骨缺损治疗及生物医学应用中具有潜在应用价值和临床研究意义。
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