目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一。其具体发病机制尚不完全清楚,临床缺乏特异性治疗措施。锌指转录因子ZNF580是一种新型锌指蛋白,其基因在人心肌、脑组织、肾脏、胰腺中的表达量较高。可以介导细胞的增殖、分化、迁移、存活和凋亡等。先前的研究显示ZNF580在缺氧心肌损伤后表达增高,并发挥抑制心肌细胞的凋亡作用,但ZNF580在神经元中的作用目前尚没有报道。本研究旨在探讨锌指转录因子ZFP580/ZNF580在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤体内体模型及神经元氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型中的表达情况,并通过慢病毒转染技术探讨了其在氧糖剥夺神经元中的保护作用,最后通过RNA-seq高通量测序和生物信息学分析其在缺氧缺血脑损伤神经元的可能分子机制,为新生儿缺氧缺血性脑损伤的诊治提供新的靶点。方法:1.选取7日龄SD大鼠,通过RICE法构建新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型,术后不同时间点断头取脑组织,一部分进行4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后病理切片,伊红苏木素即HE染色观察缺血侧脑组织细胞形态变化、原位末端转移酶标记技术即TUNEL染色观察缺血侧大脑皮层神经元凋亡情况及免疫荧光染色检测ZFP580蛋白的表达情况;另一部分留取新鲜脑组织,-80℃冰箱保存,用于提取RNA和蛋白,通过q RT-PCR和Western blot定量检测ZFP580m RNA和蛋白表达情况。所有动物均观察其行为学改变。2.运用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞系建立缺氧缺血体外模型即氧糖剥夺（OGD）神经元模型,氧糖剥夺后不同时间点提取RNA及蛋白,利用q RT-PCR及Western blot定量检测ZNF580m RNA及蛋白表达情况。细胞爬片行免疫荧光染色检测ZNF580蛋白在氧糖剥夺神经元中的表达情况。3.通过慢病毒转染技术过表达和干扰低表达ZNF580,通过荧光显微镜观察、q RT-PCR及Western blot定量检测ZNF580m RNA及蛋白检验转染效率。运用CCK-8试剂盒及流式细胞术检测ZNF580对缺氧缺血损伤神经元的细胞活性和细胞凋亡的影响。4.通过慢病毒转染技术建立过表达ZNF580和敲低ZNF580细胞株,设立对照组、ZNF580过表达组和ZNF580低表达组,每组三个生物学重复,提取RNA行转录组测序即RNA-seq。5.差异表达基因筛选与富集分析:设置差异基因筛选条件为:P value＜0.05及|log2Fold Change|＞0。基于Gene ontology数据库以及Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes（KEGG）通路数据库对差异表达基因进行功能以及通路富集分析。6.选取测序结果中的38个差异表达基因进行q RT-PCR验证。结果:1.从行为学改变、组织形态学（HE染色）以及TUNEL染色测细胞凋亡方面验证了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型的成功建立。与假手术组（Sham组）比较,HIBD组Zea Longa评分0h、6h、12h、24h、48 h差异有统计学意义（**P＜0.01）。HE结果显示:Sham组大脑皮层及海马神经元排列整齐有序。HIBD术后24h,左侧大脑皮层及海马神经元排列紊乱,细胞肿胀,空泡样变,有的细胞失去极性、变圆、胞核偏位、核仁及尼氏体不清,有些神经元细胞核固缩、崩解。术后48h,上述改变加重,神经元核固缩明显增多。Tunel结果显示:与Sham组相比,HIBD组在术后12h、24h、48h细胞凋亡率均明显增高,差异有统计学意义,**P＜0.01,***P＜0.001。与Sham组相比,HIBD组不同时间点ZFP580m RNA表达逐渐升高,12h达高峰,24h仍在高水平（P＜0.05）,不同时间点蛋白表达均升高,12h及24h仍在高水平（P＜0.05）。免疫荧光染色结果显示和Sham组相比,HIBD组海马CA1区及皮层神经元荧光强度明显增强,表明ZFP580表达显著增高。2.氧糖剥夺（OGD）后,细胞活性显著下降（P＜0.05）。随着OGD时间延长,SH-SY5Y细胞活性逐渐下降,6h时约下降至对照组细胞活性的50%左右,确定缺氧缺糖时间为6h,ZNF580m RNA及蛋白的表达在氧糖剥夺后0h、6h、12h、24h不同时间点均显著增高（P＜0.05）,12h及24h仍高水平,后逐渐下降。3.与空载体模型组相比,ZNF580低表达SH-SY5Y细胞经过OGD处理后细胞活性明显下降（P＜0.01）、细胞凋亡率明显增高（P＜0.01）,cleaved caspase-3蛋白表达量升高（P＜0.01）;相反,ZNF580过表达细胞,OGD后细胞活性显著升高（P＜0.01）、细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）,cleaved caspase-3蛋白表达量降低（P＜0.01）。4.RNA-seq结果显示ZNF580过表达组与对照组比较组合中（ZNF580vs CON）共得到7962个差异表达基因,其中3678个被上调,4284个被下调。ZNF580低表达组与对照组比较组合中（si ZNF580vs CON）共得到7198个差异表达基因,其中有3137个基因被上调,4061个基因被下调。两个比较组合间有5304个共同差异基因,ZNF580vs CON比较组合有2658个独有的差异基因,si ZNF580vs CON比较组合有1894个独有的差异基因,在5304个共同调节的差异基因中,方向一致的有248个（155/93）。5.GO功能富集分析显示在248个重叠差异基因中,涉及的生物学进程主要包括轴突再生、神经元投射发展的调节、细胞形态调节、轴突发育及再生、神经发育及神经再生、神经元凋亡过程负调节、细胞周期或细胞分裂等。KEGG通路富集分析主要涉及的关键信号通路包括铁死亡作用、谷氨酸突触功能、内质网蛋白加工、雌激素信号通路、TGF-β信号通路、n-聚糖生物合成和长寿调节通路。6.q RT-PCR验证结果显示:验证了38个基因,与RNA-seq结果相符的有27个,达70%,说明RNA-seq结果可信度高。验证结果结合文献调研显示,ZNF580在转录水平可能通过上调KLF9、IGFBP3、HSP5A基因来发挥其抗凋亡作用。结论:体内实验证实了锌指转录因子ZFP580在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型中反应性表达升高,体外实验在人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞系上获得了同样的结果。通过慢病毒转染技术过表达ZNF580和干扰低表达ZNF580后证实了ZNF580能够提高氧糖剥夺细胞模型的存活率并减轻细胞凋亡,从而减轻神经元损伤。通过RNA-seq技术和生物信息学分析推测了ZNF580在神经元中可能通过调控与神经发育、轴突导向、轴突再生以及细胞凋亡有关的基因和通路来发挥其神经保护作用。并用q RT-PCR验证了38个差异基因,结果与RNA-seq结果高度一致。结合文献调研显示从基因分子水平证实了ZNF580可能通过上调KLF9、IGFBP3、HSP5A抗凋亡基因来发挥其内源性保护因子的作用,为今后的进一步研究提供重要依据。创新点:本研究首次探讨了锌指转录因子ZFP580/ZNF580在缺氧缺血新生大鼠脑损伤中的表达情况,通过体外OGD神经元模型证实了ZNF580的内源性保护作用,在基因分子水平,采用RNA-seq及q RT-PCR证实了ZNF580通过上调KLF9、IGFBP3、HSP5A基因表达发挥其内源性保护因子的作用。不足:后续我们将在体内模型中验证其功能,并从蛋白组学水平进一步探讨ZNF580在缺氧缺血神经元中的靶向作用机制。