自上世纪90年代以来DNA疫苗在全球范围一直是基因工程疫苗研究的重点领域,但其免疫效果还难以超越传统疫苗,其根本原因是DNA疫苗进入细胞效率低和目标抗原基因不能复制而表达水平低造成的。鉴于此,本研究提出了以包装缺陷病毒为载体的自主复制型DNA疫苗技术方案:选择一个子代病毒包装必需且其不参与基因组复制的基因序列作为DNA疫苗目标抗原承载区来构建重组病毒,重组病毒可通过表达包装蛋白的反式互补转基因细胞制备。该重组病毒作为DNA疫苗能以感染的方式高效进入宿主细胞,且目标抗原基因能随病毒基因组一起复制并大量表达,从而解决导致传统DNA疫苗免疫效果不理想的问题。而且,该重组病毒在动物体内因缺乏必须包装蛋白基因不能形成子代病毒而传代和增殖,解决了现有复制型病毒载体疫苗所存在的安全性问题。主要研究内容如下:1包装缺陷型病毒PCV2-GP5感染性克隆构建运用PCR技术,以PCV2病毒g DNA为模板扩增PCV2基因组序列,并运用线性PCR重组克隆技术将PCV2基因组克隆到p Omni载体质粒上,获得PCV2的感染性克隆p Omni-PCV2。用PRRSV活病毒疫苗提取RNA进行反转录,通过PCR扩增GP5基因片段,与上一步构建的p Omni-PCV2进行线性PCR重组克隆,获得重组病毒的感染性克隆p Omni-PCV2△CAP-GP5。结果表明,成功从PCV2病毒g DNA中扩增出PCV2基因组,并成功构建了该基因的感染性克隆p Omni-PCV2;成功从PRRSV病毒RNA反转录的c DNA中扩增出GP5基因,并成功构建了突变病毒的感染性克隆p Omni-PCV2△CAP-GP5。测序结果表明克隆的GP5全长561bp,与Gen Bank上的PRRSV GP5基因序列（登录号:AEI72610.1）比对同源性为100%。GP5基因成功插入并替代了PCV2的部分Cap基因序列,且与Cap基因N端融合形成一个完整的开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）。2包装缺陷型病毒PCV2-GP5的拯救将无内毒素p Omni-PCV2△CAP-GP5质粒转入能表达PCV2病毒Cap基因的CTC-PK-15转基因细胞中,转染后的细胞在G418维持浓度下盲传3代,每代收获PCV2-GP5病毒液。提取重组病毒PCV2-GP5盲传第三代的DNA进行PCR扩增,用CTC-PK-15细胞DNA作阴性对照,p Omni-PCV2△CAP-GP5质粒作阳性对照,1%琼脂糖凝胶电泳结果显示阴性组无条带,阳性组和实验组在561bp左右有特异性扩增条带,与目的片段大小相符,证明重组病毒PCV2-GP5拯救成功。3包装缺陷病毒PCV2-GP5的增殖缺陷验证通过PCR法检测PCV2-GP5在CTC-PK-15细胞中的增殖情况,并用模板无限稀释法测定PCV2-GP5病毒滴度,然后用PCV2-GP5病毒分别感染CTC-PK-15细胞和PK-15细胞,盲传3代后进行病毒特异性PCR检测。结果表明,重组病毒PCV2-GP5在CTC-PK-15细胞中能持续增殖。模板无限稀释法得PCV2-GP5病毒DNA有扩增条带的最高稀释度为10-4,而PCV2病毒DNA有扩增条带的最高稀释度为10-5,由此可推知PCV2-GP5病毒TCID50为约10~4。PCV2-GP5病毒在CTC-PK-15转基因细胞中能复制增殖,形成具有感染性子代病毒,但其虽然对PK-15细胞具有感染性（感染第一代细胞有特异性扩增条带,证明病毒进入了细胞并进行了基因组复制）,但不能形成子代病毒,因此盲传的P2和P3均无特异性扩增条带,说明重组病毒PCV2-GP5在PK-15细胞中因为包装基因缺陷无法增殖、传代。4包装缺陷病毒PCV2-GP5表达GP5验证将包装缺陷病毒PCV2-GP5感染PK-15细胞后,分别提取阴性对照PK-15细胞和感染包装缺陷PCV2-GP5病毒的PK-15细胞RNA,经反转录和GP5基因特异性PCR扩增。结果显示,这两个总RNA样品的D260/D280的比值均大于1.8,表明提取的RNA较纯,没有蛋白质污染;RNA电泳均出现3条完整的r RNA条带,即28s r RNA、18s r RNA、5s r RNA三条带,证明提取的总RNA质量比较好。RT-PCR扩增结果显示阳性对照与实验组细胞均有特异性扩增条带,与目的基因大小一致,而阴性对照组细胞无扩增条带,说明以包装缺陷PCV2为载体的GP5基因能感染PK-15细胞并得到表达,为后续进一步进行包装缺陷PCV2-GP5病毒的动物免疫试验提供了依据。