番茄SlAGO7的克隆、鉴定及其功能研究

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ARGONAUTE(AGO)蛋白是一类高度保守且庞大的基因家族,作为沉默复合体的核心成分,在所有已知小RNA介导的沉默调控途径中发挥着关键作用。反式作用小RNA(ta-siRNA)是植物体内特有的一种內源小RNA,以剪切降解的方式对其靶标基因的mRNA进行负调控,从而影响植物正常的生长发育。AGO7蛋白是TAS3 ta-siRNA生物合成途径中必需的组分,同时TAS3 ta-siRNA的剪切作用活性也完全依赖于它。因此,AGO7蛋白在植物体内发挥的生物学功能部分是通过ta-siRNA途径来实现的。大量研究结果证实,ta-siRNA途径对侧生器官的近轴-远轴面的形态建成具有很重要且保守的调控作用。但是至今没有关于番茄 ta-siRNA途径中的一些重要基因的分离及其参与叶、花发育的报道。所以,开展番茄SlAGO7基因的功能研究对深入阐明ta-siRNA途径在番茄生长发育过程的调控机理具有重要意义。  为了研究SlAGO7的生物学功能,本文以番茄为材料,开展了以下几个方面的研究:  1、根据番茄基因组数据库中SlAGO7的EST序列信息,利用 RACE和 PCR技术从番茄花cDNA和叶基因组DNA中分别克隆SlAGO7的cDNA全长序列和基因组 DNA序列,用生物信息学方法对基因序列特征进行分析。结果显示:SlAGO7的cNDA全长片段为3238 bp,含有3003 bp的完整开放阅读框,编码1000个氨基酸,包含3个外显子和2个内含子。SlAGO7编码的氨基酸序列含有两个高度保守的PAZ和PIWI结构域,具有典型的AGO类蛋白的结构特征;与已报道的其他物种的AGO7蛋白的序列具有较高的同源性;SlAGO7基因属于AGO蛋白家族中的ZIPPY/AGO7亚家族。  2、采用定量PCR方法,对SlAGO7基因进行时空表达模式分析,结果表明:SlAGO7在营养组织叶中微弱表达,主要集中在根和茎中表达;而在生殖器官花中强烈表达,表达丰度从花蕾到盛开的花呈递增趋势,但在果实的不同发育时期中表达都非常微弱甚至不表达。为了进一步明确 SlAGO7在花中不同部分的表达特征,以开花当天的萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊为材料,进行PCR定量检测,结果发现SlAGO7在萼片中表达量最高,花瓣与雌蕊种表达适中,在雄蕊中微弱表达。这些结果为推测和研究 SlAGO7在番茄中的潜在生物学功能提供了一定的线索和思路。  3、为了深入研究SlAGO7基因的功能,分别构建了SlAGO7基因超表达载体和反义抑制表达载体并转化番茄,对SlAGO7超表达植株进行形态学特征分析,结果表明,SlAGO7基因超表达导致叶片近轴面极性发育的异常和花形态的改变;同时,SlAGO7超表达后改变了 TAS3 ta-siRNA前体及其靶标基因的转录水平,表明SlAGO7基因对番茄侧生器官极性形成的调控是通过ta-siRNA途径来实现的。  4、SlAGO7超表达之后,HD-ZIP III类转录因子SlREV、SlHB15、SlHB8、SlPHV、SlPHB的表达下调,同时,参与调控花器官形成的MADS-box转录因子SlAP2、SlAGL1的mRNA水平也发生改变,表明SlAGO7通过ta-siRNA途径可能间接地参与调节HD-ZIP III类和MADS-box转录因子的表达,从而实现对叶以及花器官形成的调控。
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