【摘 要】
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花生过敏由于其持久性和威胁生命的特性而被列为最严重的食物过敏反应之一。花生作为食物配料被广泛使用,日常饮食难以完全避免花生的摄入,降低花生过敏原致敏性的研究受到越来越多的关注。Ara h 2是花生主要过敏原之一,能被90%以上的花生过敏患者的血清识别,它的四对二硫键、三个主要过敏原线性表位,以及其中的关键氨基酸已经被定位。过敏原蛋白与Ig E结合能力由其结构决定,研究结构变化对Ara h 2潜在致
【基金项目】
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国家自然科学基金:花生过敏原蛋白Ara h 2的定向改造及其致敏特性研究（31771924）； 国家自然科学基金:基于蛋白组学的烘焙对花生基质中Ara h 2结构和致敏性影响研究（31660446）； 江西省主要学科学术和技术带头人资助计划:关键氨基酸的特性对过敏原蛋白Ara h 2致敏性的影响研究（20172BCB2
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花生过敏由于其持久性和威胁生命的特性而被列为最严重的食物过敏反应之一。花生作为食物配料被广泛使用,日常饮食难以完全避免花生的摄入,降低花生过敏原致敏性的研究受到越来越多的关注。Ara h 2是花生主要过敏原之一,能被90%以上的花生过敏患者的血清识别,它的四对二硫键、三个主要过敏原线性表位,以及其中的关键氨基酸已经被定位。过敏原蛋白与Ig E结合能力由其结构决定,研究结构变化对Ara h 2潜在致敏性的影响,可以为探索降低Ara h 2的致敏性的加工方法指示方向。本研究以花生主要过敏原蛋白Ara h 2为研究对象,为探究二硫键和主要线性过敏原表位对蛋白致敏性的影响,设计了五个Ara h 2突变体。通过基因工程技术获得重组蛋白,利用分子动力学模拟获得突变前后蛋白高级结构,并与结构表征实验数据进行比较验证,使用体外致敏性评估方法评价突变后蛋白潜在致敏性变化,揭示结构定向改造对花生过敏原Ara h 2潜在致敏性的影响。研究的主要方法、结果与结论如下:1.根据Ara h 2突变肽多肽阵列结果,选择两组低Ig E结合能力的关键氨基酸突变体破坏线性表位:Q34Y/E38Y破坏线性表位1(E26LQGDRRCQSQLER39),Y65D/Y72D破坏线性表位2(R62DPYSPSQDPYSPS75)。根据Ara h 2四对二硫键的空间位置,将连接同一个α-螺旋的半胱氨酸对分为一组:C104G/C152G/C45G/C103G破坏与α-螺旋3相连的两对二硫键（分别与α-螺旋2、α-螺旋5相连）,C118G/C160G/C33G/C116G破坏与α-螺旋4相连的两对二硫键（分别与α-螺旋1、无规则卷曲相连）,其中C33位于表位1中。设计五种突变体:突变体1突变所有两组半胱氨酸;突变体2破坏连接α-螺旋3的二硫键、线性表位1和线性表位2;突变体3破坏连接α-螺旋4的二硫键、线性表位1和线性表位2;突变体4破坏连接α-螺旋3的二硫键和线性表位2;突变体5破坏连接α-螺旋4的二硫键和线性表位2。野生型Ara h 2及五种Ara h 2突变体通过大肠杆菌BL21（DE3）原核表达,利用镍离子亲和柱梯度洗脱纯化,获得的蛋白纯度均在85%之上。2.将SWISS-MODEL同源建模的结果导入分子动力学模拟软件Gromacs进行结构优化,蛋白螺旋的长度、弯曲度发生改变。软件模拟结果显示,丢失二硫键的突变体二级结构改变,突变体的α-螺旋部分向β-转角转化,丢失四对二硫键的突变体1的β转角含量上升7.41%,螺旋含量降低5.18%。四对二硫键对蛋白、关键氨基酸和芳香族残基的溶剂可及表面积都有明显影响,突变体1溶剂可及表面积最小,为2451.1（?）~2。Q34Y/E38Y突变后蛋白中关键氨基酸的暴露面积降低,突变Q34Y/E38Y的突变体2和突变体3的关键氨基酸的溶剂可及表面积低于不突变Q34Y/E38Y的突变体4和突变体5（分别为2559.4（?）~2、2496.8（?）~2、2684.5（?）~2、2860.3（?）~2）,也都低于Ara h 2的关键氨基酸溶剂可及表面积（为2929.8（?）~2）,这表明突变后蛋白结构变紧凑,暴露的关键氨基酸被遮蔽。3.使用圆二色谱法分析突变前后蛋白二级结构变化,发现丢失C104-C152和C45-C103后蛋白更倾向于向β-转角转化,而不易形成α-螺旋,突变体2和突变体4(突变C104-C152和C45-C103)比突变体3和突变体5(C118-C160和C33-C116)的α-螺旋的含量都更低,而β-转角含量都更高,与软件模拟结果一致。软件模拟结果与圆二色谱结果相比,不同蛋白二级结构的数量有所不同,但大部分突变体二级结构组成的变化趋势一致。紫外光谱结果显示,二硫键丢失使得蛋白紫外吸强度降低,突变后蛋白的三级结构更加紧凑,与软件模拟芳香族残基溶剂可及表面积结果一致。丢失C118-C160/C33-C116后蛋白结构更紧凑,突变体3和突变体5（C118G/C160G/C33G/C116G）的紫外吸收强度低于突变体2和突变体4（C104G/C152G/C45G/C103G）。使用竞争ELISA评估突变前后蛋白潜在致敏性变化。与天然Ara h 2相比,所有突变体的Ig E结合能力都降低。野生型Ara h 2与天然Ara h 2的Ig E结合能力相当,因为重组蛋白与天然蛋白结构相似。关键氨基酸突变对Ig E结合能力的影响低于二硫键丢失对Ig E结合能力的影响,C118-C160/C33-C116丢失对蛋白Ig E结合能力影响较大,突变C118-C160/C33-C116的突变体5的Ig E结合能力最低,IC50值为5.45μg/m L。本研究通过突变破坏Ara h 2的二硫键和主要线性表位,探究结构改变对蛋白致敏性变化的影响。研究结果显示突变使得蛋白更易形成β-转角结构,关键氨基酸溶剂可及表面积降低,蛋白结构变紧凑,潜在致敏性降低。与破坏线性表位相比,二硫键丢失对蛋白潜在致敏性影响更大。
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