论文部分内容阅读
[目的]血链球菌(S.sanguinis)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)是牙周炎患者口腔中最为常见的两种病原体,它们的刺激作用能够激活血小板,并导致血小板聚集和血栓形成；同时有研究表明S.sanguinis和P.gingivalis相互之间可能存在拮抗作用。因此有必要了解S.sanguinis和P.gingivalis单独或混合菌液促进血小板凝集及其过程中的信号通路,并了解他们之间的相互作用。本研究通过检测S.sanguinis和P.gingivalis单独或混合菌液对P-选择素和纤维蛋白原结合在血小板活化中的表达,以及对血小板聚集的两条重要信号通路：PI3K通路和MAPK通路的激活下游Akt和MAPK下游p38及Erk磷酸化改变,从而探讨其在血小板活化和聚集中的信号通路。[方法]1、用血小板聚集仪研究S.sanguinis和P.gingivalis单一及混合菌液对血小板聚集所产生的促进作用,比较各组间聚集强度的差异。2、全血流式细胞仪研究S.sanguinis和P.gingivalis单一及混合菌液对血小板(?)(?)过程中P选择素和纤维蛋白原结合表达的影响,并比较各组间的差异。3、通过蛋白免疫印痕分析血小板PI3K和MAPK信号通路下游蛋白Akt、p38及Erk的磷酸化程度。[结果]1、S.sanguinis和P.gingivalis单一及混合菌液对血小板激活的影响：结果显示S.sanguinis菌液组引起血小板聚集的最高聚集率为64.84%±4.27%,P.gingivalis菌液组引起血小板聚集最高聚集率为85.31%±3.50%,S.sanguinis-P.gingivalis菌液组引起血小板聚集的最高聚集率为29.57%±11.24%,对血小板聚集均有促进作用。S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液组与单一的S.sanguinis和P.gingivalis菌液组相比明显降低,有显著性统计学差异(P<0.01),说明两种细菌的混合菌液对血小板的刺激和聚集作用明显较弱。2、全血流式细胞仪结果显示：S.sanguinis组、P.gingivalis组及混合组的纤维蛋白原结合表达率分别为15.42%±2.77%、21.87%±4.48%以及11.63%±2.83%；与阴性对照组(2.36%±2.77%)相比,S.sanguinis组和P.gingivalis的单独及混合菌液都可以明显增强纤维蛋白原的结合(P<0.01)；而与S.sanguinis菌液组相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液组的纤维蛋白原结合表达率相对较低,但没有统计学意义(P>0.05)；同时,与P.gingivalis菌液组相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液组的纤维蛋白原结合表达率明显较低,具有统计学意义(P<0.05)S.sanguinis组、P.gingivalis组及混合组的P选择素表达率分别为21.92%±6.17%、21.78%±2.99%以及10.54%±1.30%。与阴性对照组(3.55%±1.99%)相比,S.sanguinis组、P.gingivalis组及混合组的表达率明显较高(P<0.01),说明两种细菌的单一及混合菌液均能明显刺激血小板P选择素的表达；与S.sanguinis组相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液组的P选择素表达率相对较低(P<0.05)而与P.gingivalis菌液组相比,S.sanguinis-P.gingivalis菌液组的P选择素表达率明显较低(P<0.01)；这说明S.sanguinis-P.gingivalis混合菌液组对P选择素表达的作用相对单一溶液较弱。3、蛋白免疫印痕结果显示：使用兔抗人Akt单克隆抗体,鼠抗人磷酸化Akt (Ser473)单克隆抗体孵育后,可在分子量约为60kD处出现p-Akt磷酸化条带,其磷酸化强度依次为：P. gingivalis菌液组>S. sanguinis菌液组>S. sanguinis-P. gingivalis混合菌液组使用兔抗人p38 MAPK单克隆抗体,鼠抗人磷酸化p38 MAPK(Thr180/Tyr182)单克隆抗体孵育后,可在分子量约为40kD处出现p-p38磷酸化条带,磷酸化强度依次为：P.gingivalis菌液组>S.sanguinis菌液组>S.sanguinis-P. gingivalis(?)昆合菌液组；使用兔抗人Erk MAPK单克隆抗体,鼠抗人磷酸化Erk MAPK单克隆抗体孵育后,可在分子量约为40kD处出现p-Erk磷酸化条带,磷酸化强度依次为：P. gingivalis菌液组>S.sanguinis菌液组>S.sanguinis-P. gingivalis混合菌液组。[结论]本实验主要探讨了血链球菌和牙龈卟啉单胞菌单一或混合菌液刺激血小板活化和聚集的机制。结果显示：1,S.sanguinis-P.gingivalis单一和混合菌液能够导致血小板的聚集作用,且混合组的强度相对较低。2、S.sanguinis-P.gingivalis单一和混合菌液可以明显导致较高程度的纤维蛋白原结合及P选择素的表达,且混合组和单一菌液组的表达程度存在明显差异。3、S.sanguinis-P.gingivalis单一和混合菌液可以刺激PI3K和MAPK信号通路的激活,分别表现出其下游蛋白Akt、p38和Erk的磷酸化,且混合菌液所导致三种蛋白的磷酸化程度小于单一菌液组。以上结果表明S.sanguinis-P.gingivalis单一和混合菌液均能引起血小板活化,并且两种细菌之间可能存在着拮抗作用。而这两种细菌引起血小板活化和聚集的分子生物学机制,还有待进一步深入研究。