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1 实验目的研究表明,炎症反应是缺血-再灌注性脑损伤级联反应的关键环节,而微血管内皮细胞表面多种粘附分子的表达又调控着炎症反应的进行。所以,抑制粘附分子的表达,可以减轻炎症反应,从而使再灌注损伤的程度减轻,范围减小。临床和实验研究证实了黄连解毒汤复方和其中的主要单体有较好的脑保护作用,所以我们用大鼠脑微血管内皮细胞的缺氧/复氧模型模拟缺血-再灌注损伤,从细胞的活化、粘附分子的基因表达及其转录调控的角度探讨黄连解毒汤的主要有效成分单体(栀子苷、黄芩苷和小檗碱)防治缺血-再灌注性脑损伤时炎症反应的作用环节和疗效机制。2 实验方法2. 1 原代分离、纯化、培养大鼠脑微血管内皮细胞,并采用形态学、免疫细胞化学、扫描电镜技术鉴定细胞。2. 2 通过形态学观察和MTT实验,确定最佳缺氧和复氧时间,复制缺氧/复氧损伤模型。2. 3 通过形态学观察和MTT实验,检测不同浓度的栀子苷、黄芩苷、小檗碱和清开灵分别在正常培养状态下和缺氧/复氧损伤时对大鼠脑微血管内皮细胞活性的影响,并确定各药物的最佳浓度。2. 4 采用免疫细胞化学方法和图象定量分析技术测定缺氧/复氧损伤后不同浓度的不同药物对大鼠脑微血管内皮NF-κB表达的平均光密度、平均面积、核移位百分率和细胞胞核/胞浆透光度比值。平均光密度和平均面积表示NF-κB的蛋白表达,核移位百分率和细胞胞核/胞浆透光度比值表示NF-κB蛋白核移位的多少和NF-κB的核转录活性高低。2. 5 采用免疫细胞化学方法和图象定量分析技术测定缺氧/复氧损伤后不同浓度的不同药物对大鼠脑微血管内皮ICAM-1和VCAM-1表达的平均光密度和平均面积。2. 6 采用RT-PCR的方法和图象定量分析技术分析缺氧/复氧损伤后不同浓度的不同药物对大鼠脑微血管内皮ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表达。2. 7 实验结果采用SPSS11. 0进行数据统计和方差分析。3 实验结果3. 1 细胞分离过程中见到较多微血管段,细胞单层融合生长,扫描电镜观察到微绒毛、窗孔结构和细胞间连接紧密等,以及免疫荧光检测Ⅷ因子相关抗原阳性,证实我们分离培养的细胞为大鼠脑微血管内皮细胞。3. 2 体外培养大鼠脑微血管内皮细胞。缺氧4h再复氧12h为本实验的最佳缺氧和复氧时间,成功复制缺氧/复氧损伤模型。3. 3 综合在正常培养状态下和缺氧/复氧损伤状态下的MTT结果,确定实验中采用各个药物的最佳终浓度分别是0. 128、 0. 064、 0. 032μmol/ml栀子苷,0. 028、 0. 014、 0. 007μmol/ml黄芩苷、0. 024、 0. 012、 0. 006μmol/ml小檗碱和0. 025%清开灵。