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天然免疫是机体的第一道防御屏障,其通过一系列模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRR）识别各种病原相关分子模式（PAMP）,进而启动细胞天然免疫应答,因此PRR在天然免疫中发挥着重要作用。PRR主要包括Toll样受体（TLR）、RIG-I样受体（RLR）、NOD样受体（NLR）、C型凝集素样受体（CLR）和胞浆DNA受体（CDR）等。其中RIG-I样受体（RLR）为胞质内双链RNA（dsRNA）识别受体,由RIG-I、MDA5和LGP2组成,三者可通过介导或影响Ⅰ型干扰素（IFN）信号应答从而启动抗病毒尤其抗RNA病毒免疫反应。RIG-I和MDA5具有相似的结构。RIG-I能够优先识别短双链dsRNA（＜300bp）和5’端含有三磷酸基团的dsRNA（5’-ppp-dsRNA）,而MDA5则能够优先识别长链dsRNA（＞1000bp）。活化的RIG-I和MDA5通过与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）结合,招募TRAF3和TRAF6,形成信号复合物。信号复合物活化下游蛋白激酶TBK1和IKKε,进而激活转录因子IRF3和NF-κB,最终产生IFN和促炎细胞因子,发挥抗病毒作用。与RIG-I、MDA5相比,LGP2缺少N端串联CARD信号活性区,不能激活下游信号,但LGP2可通过较强的dsRNA结合力来调控RIG-I和MDA5介导的IFN信号从而影响抗病毒作用。RLR在识别和抵御动物病毒感染中同样发挥了关键作用,但是动物RLR包括RIG-I、MDA5和LGP2的研究受到限制,其主要原因为缺少特异性检测抗体工具。因此研制畜禽RLR蛋白的特异单克隆抗体显得尤其重要和迫切。本研究采用原核系统表达猪源RLR LGP2蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备其特异性单克隆抗体,并对所制备猪源LGP2、RIG-I和MDA5单克隆抗体的系统特性与功能进行鉴定。旨在为深入研究猪RLR蛋白的分子结构、组织细胞定位以及与病毒的互作机制提供研究工具,并为建立快速简便的检测方法奠定基础。主要研究内容如下:1、猪LGP2基因克隆、表达和蛋白纯化从猪巨噬细胞（3D4/21）中提取总RNA,RT-PCR扩增猪LGP2（pLGP2）的编码基因,pLGP2与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒。将上述重组中间质粒与目的真核表达载体pDSET47进行特异位点性重组（LR）,获得重组真核表达质粒pDEST47-pLGP2-2HA。利用Western-blot（WB）确认该重组质粒在转染293T细胞中的蛋白正确表达,为后期单克隆抗体筛选提供了实验材料。同时将上述重组中间质粒与目的原核表达载体pDSET527进行特异位点性重组（LR）,获得重组原核表达质粒pDEST527-pLGP2-2HA,并转化DE3/BL21感受态大肠杆菌（E.coli）进行原核表达和蛋白纯化。pLGP2原核表达最佳条件为1mM IPTG,37℃诱导6-9 h。用标签抗体HA和His进行WB分析表明,pLGP2表达蛋白分子量为80 kD,符合预期,并且蛋白主要在细菌包涵体中表达。通过尿素溶解包涵体和浓度梯度透析方法纯化包涵体中的pLGP2蛋白。经考马斯亮蓝染色并与标准BSA蛋白比对,获得浓度为1 mg/mL、共约20mg的pLGP2纯化蛋白。2、猪LGP2单克隆抗体的制备将纯化pLGP2蛋白按照最佳免疫程序免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,在细胞融合前尾静脉采血并分离血清。ELISA测定血清抗体效价,并选取血清效价最高的免疫小鼠进行加强免疫和后续细胞融合实验。取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）融合获得杂交瘤细胞。通过ELISA检测杂交瘤细胞上清中的抗体效价,基于OD450值筛选出P/N值≥2.1的阳性杂交瘤细胞株。进一步用WB检测ELISA阳性杂交瘤细胞上清与真核表达pLGP2的反应性,结果表明2株pLGP2阳性杂交瘤细胞上清和免疫小鼠血清均可以特异性地识别真核pLGP2蛋白,说明pLGP2单克隆抗体细胞株制备成功。将2株pLGP2阳性杂交瘤细胞以1-3×106（0.3 mL）细胞量腹腔接种小鼠制备LGP2单抗腹水,为pLGP2蛋白相关功能研究提供研究材料和工具。3、猪RIG-I、MDA5和LGP2单克隆抗体的鉴定与应用使用抗体亚型鉴定试剂盒检测上述制备的2株pLGP2单抗和我们实验室之前制备的pRIG-I和pMDA5各1株单抗的亚型,结果显4株单抗均为IgG2b亚型。WB结果表明,pRIG-I、pMDA5和pLGP2单抗均可识别相应的转染细胞表达蛋白和细胞内源刺激表达蛋白,但三者相互之间无交叉识别反应。克隆并构建pRIG-I/pMDA5的N端2CARDs区和C端Δ 2CARDs区的pcDNA-2HA重组表达质粒。将上述重组质粒转染293T细胞,WB检测RIG-I和MDA5单抗与表达蛋白的反应性,结果表明,猪pRIG-I和pMDA5单抗分别识别相应蛋白的C端Δ2CARDs区,与N端2CARDs区无反应。将pLGP2的N端解旋酶ATP结合域（L1）、中间解旋酶CTER域（L2）和C端CTR域（L3）重组pcDNA-2HA表达质粒分别转染293T细胞,WB检测pLGP2单抗与L1、L2和L3的反应性,结果表明2株pLGP2单抗均识别N端的解旋酶ATP结合域（L1）。分别将人的MDA5,RIG-I,LGP2表达质粒转染293T细胞,WB测试pRIG-I、pMDA5和LGP2单抗的反应性,结果表明,pRIG-I和pMDA5单抗与人的RIG-I和MDA5没有交叉反应性;pLGP2单抗（B9-2）与人LGP2没有交叉反应性,而pLGP2单抗（A1-3）与人LGP2有交叉反应性。这些结果表明,我们获得了猪源RLR家族三种蛋白高度特异的单克隆抗体。通过荧光定量PCR方法检测正常猪和PRRSV感染猪不同组织（心、肝、脾、肺、肾、淋巴结）中pRIG-I、pMDA5和pLGP2基因表达。结果显示,PRRSV感染猪与正常猪相比较,除心脏之外其它组织中的RLR表达水平都有显著的升高,提示RLR在PRRSV感染中发挥了重要作用。将PRRSV感染猪的不同组织进行切片处理,使用我们制备的pRIG-I、pMDA5和pLGP2特异性单抗进行免疫组化实验,结果表明,pRIG-I、pMDA5和pLGP2主要集中在肝脏和肾脏,其次是淋巴结和脾脏,与荧光定量PCR结果相一致。