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目的:分离培养原代大鼠海马细胞,在低温环境下构建糖氧剥夺/再灌注(oxygenglucose deprivation/reperfusion,OGD/R)海马细胞模型体外模拟深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)诱导的神经损伤,探究低温OGD/R刺激对海马细胞外泌体(exosomes,Exo)内mi R-200家族表达的影响,以及氢气对外泌体mi R-200家族的调控作用。方法:原代分离培养大鼠海马神经细胞,采用神经元特异性的抗体(烯醇化酶,NSE)对其鉴定。将生长状态稳定的海马神经细胞分为4组分别提取培养基中的外泌体:a对照组:NC-Exo;b通氢组:H2-Exo;c低温OGD/R组:OGD/R-Exo;d低温OGD/R+H2组:OGD/R+H2-Exo。透射电子显微镜观察外泌体形态,Western blot检测外泌体标志蛋白CD63表达,纳米微粒追踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径,Real Time-PCR检测外泌体内mi R-200家族的表达。结果:成功获取原代海马细胞,且细胞纯度>90%,可用于后续研究。外泌体鉴定显示:所获取物在透射电镜下观察呈圆形或椭圆形囊泡状,可分散或聚集分布;Western blot显示其表面可表达CD63外泌体表面分子标志物;NTA检测显示,所获取物直径主要集中在70-80nm,平均直径为104±57.5nm。与NC组相比,低温OGD/R刺激后外泌体内mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141和mi R-429基因表达显著上调,且mi R-200b基因上调最明显。60%的氢气处理可使海马细胞外泌体内mi R-200a,mi R-200b,mi R-200c,mi R-141和mi R-429基因表达显著下调。NC-Exo组和H2-Exo组mi R-200家族表达无明显差异。结论:成功建立了海马细胞低温糖氧剥夺/再灌注模型并获取了海马细胞培养基中的外泌体。低温OGD/R刺激可使海马细胞外泌体内mi R-200家族表达上调,其中以mi R-200b基因表达变化最显著;通氢处理可逆转低温OGD/R刺激导致的外泌体内miR-200家族表达上调。目的:探究外泌体mi R-200b在低温OGD/R损伤形成和发展中的作用,进一步研究外泌体mi R-200b在氢气发挥深低温停循环脑保护作用的意义。方法:按照以下分组将外泌体与正常海马细胞共培养:A对照组;B海马细胞+OGD/R-Exo组;C海马细胞+(OGD/R+H2-Exo)组;D海马细胞+(OGD/R-Exo)+mi R-200b抑制剂。Real Time-PCR检测共培养海马细胞内mi R-200b表达;噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法检测共培养海马细胞活力与增殖;二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)探针检测细胞活性氧(Reactive oxygen speicies,ROS)变化;Western blot检测共培养海马细胞凋亡相关蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Bax表达;流式细胞仪检测海马细胞凋亡情况。结果:低温OGD/R刺激后的Exo可使共培养细胞内mi R-200b表达上调,细胞增殖与活力下降,细胞内ROS增多,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl表达减少,促凋亡蛋白Bax表达增多,流式细胞仪分析发现共培养细胞凋亡和坏死增多。氢气预处理后的OGD/R-Exo可降低共培养海马细胞内mi R-200b上调水平,细胞损伤得到改善,细胞活性增加,胞内ROS减少,细胞凋亡减少。结论:外泌体通过转运“毒性”miR-200b诱导低温OGD/R损伤在海马神经细胞之间形成和进展,氢气通过抑制外泌体mi R-200b表达发挥糖氧剥夺/再灌注神经元保护作用。