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第一部分14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质、纹状体及PC12细胞中的分布目的探讨14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质、纹状体以及PC12细胞中的分布情况,为研究14-3-3蛋白在PD发病中的作用提供形态学依据。方法本实验采用了免疫组化/免疫荧光和免疫印迹技术。结果免疫组化/免疫荧光结果显示:在大鼠黑质内,14-3-3蛋白γ、ε、θ、ζ四个亚型免疫反应阳性,而β和η亚型未见明显免疫反应;在纹状体,同样只见γ、ε、θ、ζ四个亚型免疫反应阳性;在PC12细胞中,6个亚型均呈免疫荧光阳性反应;光镜下显示,14-3-3蛋白各亚型免疫反应主要位于胞浆,胞核未见明显阳性着色。Western blot结果显示在黑质中14-3-3各亚型的表达量分布为ε>γ>ζ>θ;在纹状体14-3-3各亚型的表达量分布为ε>γ>ζ>θ;在PC12细胞中各亚型的表达量的分布为γ>ε>β>ζ>η>θ。结论大鼠黑质、纹状体中存在ε、γ、ζ和θ四种亚型,说明只有这四种亚型可能与PD的发病有关;同时ε亚型含量最多,提示此亚型可能起主要作用。PC12细胞中含有γ、ε、β、ζ、η和θ六种亚型,且其分布与黑质及纹状体很相似,因此是研究14-3-3蛋白作用的很好细胞模型。第二部分14-3-3蛋白在PD动物模型及细胞模型中表达的变化目的观察14-3-3蛋白在PD大鼠模型黑质中及在MPP+诱导的PC12细胞模型中表达的变化,并探讨14-3-3蛋白表达的变化与多巴胺能细胞死亡之间的关系。方法①用6-OHDA进行单侧中脑黑质立体定位注射,建立偏侧PD模型,用阿朴吗啡诱导大鼠的旋转行为,检验模型的成功。用RT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测14-3-3表达的变化;②用MPP+处理PC12细胞建立PD细胞模型,用western blot检测MPP+对14-3-3蛋白表达的影响,同时用MTT法检测MPP+对PC12细胞活力的影响。结果①RT-PCR检测结果显示,在6-OHDA诱导的偏侧PD大鼠模型中脑黑质中各亚型14-3-3 mRNA的表达无显著性变化;Western blot显示免疫反应阳性的四个14-3-3蛋白亚型的蛋白水平均下调。②在MPP+诱导的PC12细胞模型中,14-3-3蛋白的表达随着MPP+处理的时间延长呈下降趋势,在6h变化不明显, 12h显著下降(P<0.05),到48h后14-3-3蛋白的减少极其显著(P<0.01);PC12细胞的存活率也呈现同样的变化趋势,在6h变化不明显, 12h显著下降(P<0.05),到48h后14-3-3蛋白的减少极其显著(P<0.01)。结论在6-OHDA诱导的PD大鼠模型黑质中,14-3-3 mRNA的表达变化无显著性差异,而蛋白的水平显著降低;在MPP+诱导的PD细胞模型中14-3-3蛋白的表达随着MPP+作用作用时间的延长呈现逐渐下降的趋势,同样细胞的存活率也随着MPP+作用时间延长呈现同样的下降趋势,因此我们推测,14-3-3蛋白水平的降低可能与细胞的死亡相关。第三部分含人14-3-3 DNA质粒的构建及稳定过表达14-3-3蛋白细胞株的建立目的为了建立稳定过表达14-3-3蛋白的细胞株,为下一步实验作准备。方法利用基因重组技术先构建真核表达的pcDNA3.1(+)-14-3-3质粒,通过酶切和基因测序验证所构建的质粒目的基因的正确无误;然后通过脂质体2000将重组质粒和pEGFP质粒共转染到PC12 cell,首先观察转染效率,然后通过免疫荧光技术和免疫印迹技术检测转染质粒携带的目的基因在PC12 cell内的表达情况。结果酶切鉴定结果显示,重组质粒组可见两个酶切条带,上一个为质粒骨架的条带,在约900bp处见到的条带为目的基因的条带,而空质粒对照组只见一条质粒骨架条带;测序的结果通过与Genebank所查到的相应基因序列比较完全相符,说明质粒的重组构建成功。将pcDNA3.1(+)-14-3-3质粒和pEGFP质粒共转染到PC12 cell,通过荧光显微镜观察到,在转染后24h绿色荧光蛋白开始表达,但发绿色荧光的细胞比较少,在第2～6d,表达绿色荧光的细胞逐渐增多,而且绿色荧光也越来越强。Western blot结果显示,pcDNA3.1(+)-14-3-3转染组14-3-3蛋白的表达与正常对照组和空质粒转染组相比显著增加。结论成功构建了pcDNA3.1(+)-14-3-3质粒并建立了过表达14-3-3蛋白的细胞株,为下一步实验做好了准备。第四部分14-3-3蛋白的过表达抵抗MPP+对PC12细胞毒性作用的研究目的探讨14-3-3蛋白过表达对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞损伤的保护作用方法构建pcDNA3.1(+)-14-3-3真核表达质粒,转染PC12细胞,建立稳定过表达14-3-3蛋白细胞株;通过四甲基偶氮唑盐法(MTT法)、流式细胞术和DAPI凋亡检测法分别检测14-3-3蛋白过表达对MPP+诱导的PC12细胞存活力、细胞凋亡和凋亡率的影响。结果14-3-3蛋白过表达显著增加PC12细胞活力(质粒转染组:0.78±0.06,MPP+组:0.54±0.07)、抑制细胞的凋亡(质粒转染组:(11.87±3.26)%,MPP+组:(36.30±2.39)%)。结论14-3-3蛋白过表达对MPP+的毒性有保护作用。第五部分14-3-3蛋白的过表达抵抗MPP+对PC12细胞毒性作用的机制研究目的探讨14-3-3蛋白过表达对MPP+毒性保护作用的可能机制。方法用基因重组技术建立过表达14-3-3蛋白细胞株,用浓度100μmol/L的MPP+诱导PC12细胞凋亡,建立PD细胞模型,分别采用western blot技术和酶标仪检测BAD和p-BAD蛋白的表达以及SOD和GSH-Px活性变化情况。结果western blot结果显示MPP+使PC12细胞中BAD蛋白的表达显著下降;14-3-3蛋白的过表达却使p-BAD蛋白的表达明显升高;同时14-3-3蛋白过表达能增加SOD活性(质粒转染组:9.13±0.41 U/mg,MPP+组:6.45±0.52 U/mg)和GSH-Px活性(质粒转染组:89.66±3.42μmol/mg,MPP+组:82.73±4.15μmol/mg)。结论14-3-3蛋白过表达对MPP+的细胞毒性有保护作用,这种作用可能通过增加p-BAD蛋白的表达、增加SOD和GSH-Px的活性,抑制细胞凋亡而实现的。