阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）,又称为老年痴呆症,是一种多发于老年人群的神经退行性疾病,也是痴呆症最常见的病因。预计到21世纪中叶,全世界患痴呆症的人数将增加到1.315亿。淀粉样斑块（amyloid-βprotein,Aβ）和神经原纤维缠结是阿尔茨海默病的两大主要病理特征。尽管进行了数十年的研究,但至今尚未开发出有效的治疗方法。针对AD发病的各种机制研发了多种药物,尽管已证明这些药物对AD的症状的控制具有统计学意义,但它们的治疗功效远非稳定,并且作用持续时间有限。基于现有疗法的低效率,人类迫切需要开发具有阻止疾病发展的能力的药剂,而Aβ通道小分子阻断剂将会是治疗AD相关病理的一种新颖且有希望的化合物。Aβ的毒性作用是AD发展的重要因素,这也是目前科研人员广泛接受的事实。Aβ离子通道假说是Aβ发挥毒性的一种机制,该假说认为,Aβ变构、组装成离子通道结构并嵌入脂质双层膜,此通道对钙离子有通透性,从而破坏了细胞的钙稳态,导致钙过载,导致了神经元的超兴奋及神经元凋亡和坏死。AD是一种进展缓慢的神经退行性疾病,离子通道形成后造成不可逆转的伤害,现有基于清除Aβ的药物的失败有可能是因为Aβ通道已经形成,此时即使清除了Aβ却无法逆转通道的形成,因此在临床后期,药物的疗效不能起到好的作用。Aβ通道假说最大的质疑则是无法直接证明Aβ通道的毒性作用,以及在过去的研究中Aβ所用浓度与生理浓度相差太大,使得该假说不被广泛认可。本研究目的则是观察Aβ通道在慢性Aβ诱导的海马神经元凋亡中的作用,为证明Aβ通道假说的科学性补充证据。在实验设计上,本实验采用7天连续给予0.1μmol/L Aβoligomers（AβOs）处理的慢性损伤凋亡模型,使用与Aβ通道相关但其机制不同的阻断药物Bexarotene和Anle138b从细胞模型上分为通道形成前和通道形成后两个方面进行验证。Bexarotene能和胆固醇竞争与Aβ的结合并阻止离子通道的形成,Anle138b是能够在通道形成后将其阻断并改善Aβ病理的化合物。本实验模型使用原代培养的海马神经元,成熟的海马神经元能形成神经网络,细胞之间能进行信号传导,并且降低AβOs的用量,采用慢性给药,相较于急性分离模型更加接近生理环境,此外选取两种机制不同的药物实验,实验结果也更具有说服力。结果如下:1.应用Map2和Hochest双染检测原代培养的海马神经元纯度。结果表明培养8天的神经元已经成熟,并且神经元Map2阳性率95%以上。2.原子扫描显微镜下观察到Aβ不同的聚合状态;Western Blot鉴定AβOs的聚合状态,结果显示,有未聚合的单体（4 k Da）;有聚合好的AβOs,包括三聚体（12 k Da）、五聚体（20 k Da）、七聚体（28 k Da）、十二聚体（48 k Da）等。3.用0.1μmol/L的AβOs连续7天处理海马神经元。与对照组相比,AβOs组细胞存活率降低（n=4,P<0.05）,LDH释放量增加（n=6,P<0.05）,结果表明AβOs慢性处理海马神经元诱导损伤和凋亡。4.用CCk-8技术和LDH试剂盒检测0.1μmol/L Bexarotene培养7天的海马神经元损伤程度。结果显示与对照组相比,0.1μmol/L Bexarotene本身处理对海马神经元没有损伤作用（n=5,P>0.05）。5.用膜片钳技术检测Aβ打孔。结果显示电极封接后,电阻较大,此时不产生电流,0.5μmol/L AβOs处理细胞30 min后,细胞膜电阻变小,外向钾电流出现。这说明细胞膜完整性遭到破坏,提示0.5μmol/L AβOs处理后,在细胞膜上成功产生孔道。6.LDH试剂盒检测Bexarotene对AβOs诱导凋亡模型中乳酸脱氢酶释放量的影响。0.1μmol/L AβOs连续7天处理海马神经元后,与空白对照组相比,海马神经元LDH释放量增加（n=5,q=4.886,P<0.01）,在0.1μmol/L AβOs和0.1μmol/L Bexarotene共同处理海马神经元,与AβOs处理组相比,海马神经元LDH释放量下降（q=5.105,P<0.01）,提示Bexarotene可以预防AβOs引起的神经毒,对神经元具有保护作用。7.用Western-blot（WB）技术检测各组细胞bcl-2和bax蛋白表达量的比值。与AβOs处理组相比,0.1μmol/L AβOs和0.1μmol/L Bexarotene共同处理海马神经元,bcl-2与bax的比值升高（q=3.328,P<0.05）,进一步证明了Bexarotene神经保护作用。8.LDH试剂盒检测Anle138b对AβOs诱导凋亡模型中LDH释放量的影响。与对照组相比,用AβOs处理海马神经元7天后,海马神经元LDH释放量增加（n=4,q=6.076,P<0.05）,在加药最后2天,用0.1μmol/L Anle138b处理海马神经元,与AβOs 7天处理组相比,可减少海马神经元LDH释放量（q=4.313,P<0.05）,表明Anle138b可以反转AβOs引起的神经毒从而保护神经元。接着又检测了阻断通道形成药物Bexarotene在最后两天加入对神经元的影响,结果显示后两天加入Bexarotene不能对抗AβOs诱导的毒性作用。9.用WB技术检测各组细胞cleaved caspase-3蛋白表达情况,来判断细胞凋亡情况。与对照组相比,AβOs 7天处理组的cleaved caspase-3表达增加（n=9,F=6.979,q=5.970,P<0.01）。在加药最后2天,用0.1μmol/L Anle138b处理海马神经元,与AβOs 7天处理组相比,cleaved caspase-3表达降低（q=4.091,P<0.05）,进一步证明了Anle138b的神经保护作用。10.用LDH试剂盒检测不同浓度Anle138b对海马神经元LDH释放量的影响。Anle138b减少了AβOs诱导的海马神经元LDH的释放量,并且表现出浓度依赖性。综上所述,连续7天用AβOs处理海马神经元,促进神经元凋亡,加重对细胞的损伤,是一种较好的AβOs细胞毒性模型。实验表明Bexarotene与AβOs共处理7天可以防止AβOs的神经毒,具有神经保护作用。进一步实验表明,Anle138b在慢性AβOs诱导的海马神经元凋亡模型的相对后期介入也具有神经保护作用。本实验的研究结果表明,两种Aβ通道阻断剂能够对抗AβOs诱导海马神经元产生的毒性,从而证明了Aβ通道在AβOs诱导海马神经元损伤和凋亡过程中发挥一定作用。因此,对Aβ通道抑制剂的进一步研究可能为开发治疗AD新型药物提供思路和靶点。