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研究目的：(1)离子通道在细胞增殖、分化和凋亡中的作用，目前已成为国际研究热点。关于骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是否存在离子通道的表达，具有什么样的离子电流，是否参与了MSCs的增殖和分化过程，国内外报道都不多。本实验旨在对骨髓间充质干细胞的多种离子电流和离子通道表达情况进行研究，为进一步探讨离子通道在MSCs增殖和分化中的作用提供基础。(2)钙敏感受体(calcium-sensingreceptor，CaR)作为G蛋白耦联受体，可以感受到胞外钙离子微小变化。关于CaR的研究目前主要集中于它对钙稳态的调节，最新研究表明，CaR在造血干细胞的“归巢”中具有关键性作用。本试验旨在观察MSCs是否也存在CaR的表达，及其介导的信号转导途径，CaR激动剂对MSCs的诱导分化作用，为阐明MSCs增殖和分化的机制提供理论基础。
实验方法：(1)应用梯度密度离心与差速贴壁消化法相结合分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，利用细胞免疫荧光化学方法通过CD29、CD44、CD106、CD14、CD34、CD45表达的阳性率进行鉴定。分别应用5-氮胞苷(5-Aza)和心肌细胞微环境诱导MSCs向心肌样细胞分化，并观察诱导分化前后动作电位相关离子通道基因的表达变化，以及L-型钙通道对分化的影响。(2)应用全细胞膜片钳技术记录MSCs的离子电流，RT-PCR检测多种离子通道mRNA的表达情况。(3)应用RT-PCR、细胞免疫荧光化学、westernblot方法检测钙敏感受体在MSCs的表达。应用钙离子荧光探针Fluo-3/AM与激光共聚焦显微镜和westernblot观察CaR与细胞内钙信号和ERK1/2蛋白的关系。
结果：(1)梯度密度离心与差速贴壁消化法相结合分离培养的MSCs，CD29、CD44、CD106的阳性率在93％左右，而造血谱系标记CD14、CD34、CD45的表达则为阴性。10μmol/L的5Aza和与心肌细胞直接接触共培养可以诱导MSCs向类心肌细胞分化，L-型钙通道的阻断剂nifedipine不能抑制这种分化。RT-PCR检测到诱导分化前的MSCs存在编码L-型钙通道的α1C、编码Iks的KvLQT1、编码Ierg的erg1基因的表达，而诱导后的细胞不仅存在上述三种基因的表达，同时又出现了与动作电位相关的编码L-型钙通道的α1D、T-型钙通道的α1G亚基基因，编码内向整流钾通道的Kir2.1基因，编码TTX-敏感性钠通道的SCN5A基因的表达。(2)在MSCs记录到两种外向电流Ito、Ik以及内向电流INa、ICa-L，同时发现MSCs高表达KvLQT1基因、erg1基因、α1C亚基基因、编码Ito的Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3基因，编码多巴胺受体的DAl基因，低表达或不表达Kir2.1基因，SCN5A基因，编码L-型钙通道的α1D、α1S亚基和T-型钙通道的α1G、α1H亚基基因。(3)在MSCs检测到CaR基因和蛋白的表达，细胞外钙离子浓度的增加可以迅速引起细胞内钙离子升高以及ERK1/2的磷酸化。
结论：(1)本研究说明梯度密度离心与差速贴壁消化法相结合分离培养大鼠骨髓间充质干细胞是可靠可行的。5-Aza和与心肌细胞直接接触可以诱导MSCs向心肌细胞分化，而L-型钙电流和心肌细胞搏动产生的机械刺激并不是分化的必要条件。诱导分化前后的细胞离子通道表达的不同，提示这些离子通道可能参与了MSCs向心肌的分化。(2)大鼠MSCs细胞膜电位在-16～-54mV之间，不同传代次数的细胞，在电流种类和密度上没有明显差别，提示在增殖过程中，MSCs的电生理特性是稳定的。部分细胞分别或者同时存在Ito、Ik、ICa-L、INa。同时发现在MSCs具有多种离子通道基因的表达，提示离子通道在调控MSCs的增殖和分化中具有一定的作用。(3)本实验发现在骨髓间充质干细胞具有钙敏感受体的功能性表达，钙敏感受体的激活可以引起细胞内钙离子的迅速增加以及ERK1/2的磷酸化激活，表明钙敏感受体在MSCs的增殖和分化中具有一定的作用。