属于鳞翅目昆虫的家蚕,体内物质的代谢的重要器官—马氏管与其他昆虫的马氏管(肾管)乃至哺乳动物的肾脏有着很大的相关性,也具有其独特的特征。对于家蚕马氏管重要功能性蛋白质的发现和研究可以为我们更好地理解昆虫马氏管(肾管)的功能,在漫长的进化过程中,因为不同的进化需要,昆虫和哺乳动物共有和不同的进化结果。另外,作为能够大量吐丝结茧的昆虫,家蚕的巨大经济价值已长久被人们所关注。代谢作为消化过程后的必要环节,其与家蚕生长发育的调节作用不容忽视。因此,对于家蚕马氏管的研究对于提高家蚕体质,进而提高产丝效率和产丝量可以起到一个很好推动作用。而且,家蚕马氏管具有显著区段特征的特殊构造对于研究马氏管(肾管)不同区段的功能提供了很好的条件。本研究利用丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合液相质谱(LC MS/MS)、双向电泳(2D)结合基质辅助激光解析质谱(2D-MALDI-TOF/MS)的方法分析了家蚕五龄第5天马氏管的主要表达蛋白质；并对五龄第5天的各段马氏管、五龄第5天与化蛹第1天整段马氏管的表达蛋白质进行了比较；还对蛾期马氏管代谢产物中存在的主要蛋白质进行了鉴定；利用家蚕的基因组序列、表达序列标签(ESTs)数据以及基因芯片数据,对具有显著时期和区段分布特点的蛋白质BmAGXT2、BmHYI、Bmhibadh的编码基因Bmagxt2、Bmhyi、 Bmhibadh进行了克隆和分析；同时采用RT-PCR、原核表达、Western blotting等技术对Bmagxt2、Bmhyi的功能进行了研究；测定了BmAGXT2在马氏管五龄期到蛹期、五龄期各区段中的酶活力。1.家蚕马氏管五龄第5天LC MS/MS及2D-MALDI-TOF MS分析LC MS/MS液向-质谱联用鉴定复杂蛋白质混合物的技术现在已广泛应用在蛋白质组学平台中。在本研究中采用了LTQ VELOS质谱仪,成功的鉴定了家蚕五龄第5天马氏管表达蛋白质。我们采用了构建正反库的方式和TPP软件的筛选功能对鉴定结果进行了质量控制,增加了蛋白的鉴定可信度。最终,我们一共鉴定到了1367个非重复蛋白质,其中80.54%的鉴定蛋白质理论分子量分布在10-100kD之间,98.90%的鉴定蛋白质的理论等电点分布在4-12之间；而家蚕9倍基因组预测的所有蛋白质中有82.48%的理论分子量分布在10-100kD之间,97.82%的理论等电点分布在4-12之间。其中有41个蛋白质同时在双向电泳中检测到,且这些蛋白质在双向电泳图谱中发现的表达量和APEX分析结果相似。我们对这些蛋白质进行了家族分类、GO分类、pathway分类后发现：家蚕的马氏管不仅完成了调节体内水分和盐分的作用,除了功能相似之外,其与哺乳动物的肾脏在多个代谢通路上有着相似之处,并且二者可能还有更多的关联。作为专一食桑叶的昆虫,家蚕选择了以马氏管作为场所来完成对桑叶挥发油成分的代谢。在马氏管中的GSTs、P450s、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases)等蛋白质家族来处理外源性和内源性的有害物质,达到机体免受其伤害的目的。2.五龄第5天马氏管分段双向电泳与质谱分析及代谢产物中蛋白质的鉴定通过颜色观察和查阅文献,我们发现家蚕马氏管至少可以分为3个区段,对这三个区段分别进行DAPI染色30min后的结果显示,第Ⅰ区段染色主要集中在马氏管管腔内侧；第Ⅱ区段染色质呈网状分布；第Ⅲ区段染色质呈颗粒状分布。说明这3个区段有较大的区别。为了了解马氏管各区段的蛋白质分布情况,分别对这3个区段进行了双向电泳,我们发现BmAGXT2、 BmHYI、Bmhibadh、BmActin3在各区段中有较大差异,其中BmAGXT2主要分布于第1区段(远离直肠端),第2区段、第2区段中分布较少；BmHYI、Bmhibadh在第1区段的分布量也大于其他区段；而BmActin3在第3区段中的量最大。在研究中,我们对化蛾第2天马氏管内容物中的蛋白质情况进行了双向电泳-质谱分析,成功鉴定到其中3个蛋白点,均为典型的抗菌肽蛋白质hemolin,推测可能蛹期及蛾期免疫有关。3.家蚕幼虫期和蛹期马氏管差异蛋白质组学分析利用蛋白质双向电泳技术对家蚕五龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较,并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定,应用GPMAW8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库,对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。共检测到360～430个蛋白点,主要分布在分子质量15～80kD、等电点4.0～9.5的范围内。两个时期共有17个表达量有显著差异的蛋白质被成功鉴定,其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(BmAGXT2),3一羟基异丁酸脱氢酶(Bmhibadh)等。研究结果可以为家蚕马氏管怎样实现从幼虫期代谢桑叶消化产物功能为主到蛹期代谢消耗脂肪体及储藏蛋白的产物功能为主的巨大转变提供蛋白质水平上的依据。4. Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh基因的克隆、序列分析及mRNA表达根据基因组中Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh的序列,设计引物,克隆基因,经过酶切和测序验证得到三个基因的阳性克隆。从基因结构上分析, Bmagxt2基因CDS长为2080bp,编码的蛋白含260个氨基酸残基,预测蛋白的分子量大小为50.38kD,等电点为7.70,具有9个外显子,8个内含子,在基因组上仅有一个拷贝,位于11号染色体nscaf3031上。SignalP预测没有信号肽,为分泌型蛋白；TMHMM预测没有跨膜结构。Bmhyi基因CDS长为783bp,编码的蛋白含260个氨基酸,预测蛋白的分子量大小为29.17kD,等电点为6.10,含有4个外显子,3个内含子,在基因组上仅有一个拷贝,位于nscaf2360上,染色体定位情况未知。SignalP预测没有信号肽,为分泌型蛋白；TMHMM预测没有跨膜结构。Bmhibadh基因CDS长为969bp,编码的蛋白含322个氨基酸残基,预测蛋白的分子量大小为34.01kD,等电点为9.24,含有6个外显子,5个内含子,在基因组上仅有一个拷贝,位于17号染色体nscaf2865上。SignalP预测信号肽为第1-21个氨基酸残基(MAARTILSTQCLYTAARRAYS); TMHMM预测前60个氨基酸残基为跨膜结构。为了了解三个基因在家蚕各时期、组织的表达特征,我们利用家蚕ESTs、基因芯片数据以及RT-PCR方法进行了分析。ESTs分析结果显示Bmagxt2、Bmhyi、Bmhibadh均具有EST证据。在家蚕马氏管、中肠中Bmagxt2有EST证据。在家蚕卵巢、血细胞、马氏管、中肠、脂肪体、丝腺中Bmhyi有EST证据,在家蚕中肠、翅原基、马氏管、胚胎、血细胞、脂肪体、丝腺中Bmhibadh有EST证据。对家蚕全基因组芯片的组织表达数据的分析结果显示：Bmagxt2基因在家蚕五龄第3天的各组织中的mRNA的量都很低,除卵巢、精巢、脂肪体这三个组织有极少量外,其他组织中几乎没有mRNA的存在。Bmhyi基因在丝腺、卵巢、精巢、马氏管、体壁、头、血液、脂肪体、中肠中均有不同程度的表达,其中丝腺中表达量较低,而马氏管、血液、脂肪体、中肠中表达量较高,尤其马氏管中表达量很高。Bmhibadh基因在在家蚕五龄第3天的各组织中几乎没有表达。对早期胚胎和熟蚕期到蛾期的芯片数据的分析结果显示：Bmhibadh发育时期、早期胚胎无数据。Bmagxt2基因在胚胎早期和上蔟第8-9天有很微弱量的表达,其他时期几乎不表达；Bmhyi基因在整个胚胎期、熟蚕期至蛾期都没有表达。为了进一步补充和验证表达谱,我们进行了半定量RT-PCR检测。结果显示：Bmagxt2基因在家蚕五龄第3天幼虫生殖腺、体壁、脂肪体表达量较高,在头和马氏管中有微弱表达；而从1龄眠期到五龄第7天的期间内均有表达。Bmhyi基因在家蚕五龄第3天幼虫脂肪体、表皮、血细胞中有微弱表达,马氏管中表达量较高；而从蚁蚕期到上蔟后第10天期间都有表达,整体表现为幼虫期表达量大于蛹期,上蔟后36-72h表达量小于上蔟后96h到上蔟后第10天。Bmhibadh基因在家蚕五龄第3天幼虫各组织中均有表达,马氏管和丝腺中的表达量略高于其他组织；而在幼虫期各时间点均有一定量表达,总体趋势表现为眠期表达量小于起蚕期；上蔟后该基因几乎无表达,一直到上蔟后第8天才有极微弱的表达量,并一直保持到蛾期。5. Bmagxt2、Bmhyi的原核表达、抗体制备及western blotting检测为了对基因功能进行进一步研究,我们将Bmagxt2和Bmhyi分别与p29和p28表达载体相连接,相应命名为Bmagxt2/p29和Bmhyip28,并转化到BL21(DE3)表达菌株中。IPTG诱导表达后分别得到分子量约为51kD和30kD的重组包涵体蛋白质,而目标蛋白质分子量约为50.38kD和29.17kD,加上6个组氨酸标签,大小约为51kD和30kD,与预测分子量大小基本一致。通过Ni+亲和柱和电洗脱纯化,得到了较高浓度的原核表达包涵体蛋白质BmAGXT2. BmHYI。将这两个蛋白质免疫成年健康雄兔后,取得血清,纯化得到多克隆抗体。利用抗体检测Bmagxt2和Bmhyi在家蚕五龄第5天各组织的表达情况,结果显示,BmAGXT2蛋白质在马氏管和血液中有表达,尤其在马氏管中表达量很高,这与我们在双向电泳试验中发现的现象一致。Bmhyi蛋白质只在马氏管中有表达。而进一步的双向western blotting结果显示,与五龄第5天相比较,化蛹第1天马氏管中的BmAGXT2和BmHYI都有很大程度的减少,这一结果之前的双向电泳中观察的结果一致。6.丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(BmAGXT2)活性检测为了研究BmAGXT2蛋白在马氏管中的活性情况是否与其表达量具有相关性,我们参照其在人和小鼠同源蛋白的酶活性测定方法,测定了BmAGXT2从五龄第3天到化蛹第7天以及其在五龄第5天马氏管各区段中的酶活性,结果显示：(1)BmAGXT2在家蚕幼虫马氏管中的活性从五龄第3天到五龄第7天逐渐升高；之后,则逐渐降低,整个蛹期,其活性在一个比较稳定的水平。(2)BmAGXT2在幼虫期马氏管各段中的活性以第一区段(离结肠接口最远段)最高,第二区段次之,第三区段(靠近结肠接口段)最小。暗示BmAGXT2可能与代谢强度及蚕进食桑叶有着一定的相关性,BmAGXT2主要在家蚕马氏管的第一区段中发挥其作用。