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第一部分B7-H3在胰腺癌中的表达及对患者临床预后的影响目的:探讨B7-H3分子在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌患者临床预后的关系。方法:应用实时定量PCR（Real-time PCR）及免疫组化方法检测31例胰腺癌患者癌组织及癌旁胰腺组织中B7-H3 mRNA与蛋白的表达情况,并采用生存分析探讨其表达水平与患者预后的关系。结果:Real-time PCR方法检测B7-H3 mRNA在胰腺癌组织中相对表达水平为（2.04±0.78）,在癌旁胰腺组织中B7-H3 mRNA相对表达水平为（0.64±0.90）,两者之间的差异具有统计学意义（P<0.001）;免疫组化检测结果显示B7-H3在癌旁胰腺组织中的表达低于胰腺癌组织（χ2=11.33,P=0.0008）;单因素生存分析结果显示B7-H3高表达的患者预后较差,B7-H3低表达患者则具有更好的总生存率（P=0.008）。结论:协同共刺激分子B7-H3在人胰腺癌组织中高表达,与患者预后密切相关,有望成为监测胰腺癌进展的重要指标。第二部分慢病毒转染技术构建稳定过表达B7-H3基因的人胰腺癌Panc-1细胞株目的:建立B7-H3重组慢病毒载体,使之转染人胰腺癌Panc-1细胞且稳定高表达B7-H3分子的细胞株,为后续研究提供基础。方法:设计B7-H3引物,PCR扩增目的基因片段,酶切载体后重组B7-H3-GV287表达载体,氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞,包装、收获、浓缩慢病毒并测序及测定病毒滴度,转染Panc-1细胞,采用流式细胞仪（FCM）、Real-time PCR、Western Blot等对B7-H3的表达情况进行鉴定。结果:测序结果证实B7-H3基因正确插入载体中。B7-H3-GV287慢病毒转染293T细胞后,B7-H3基因在蛋白水平上表达明显增加。慢病毒包装成功,并完成滴度测定:2×108 TU/mL。慢病毒转染人胰腺癌Panc-1细胞后,B7-H3基因在mRNA以及蛋白表达水平明显增加,细胞膜上的B7-H3分子表达也相应提高,野生型人胰腺癌Panc-1细胞株则低表达B7-H3,差异均具有统计学意义（P值均小于0.05）,高表达B7-H3的人胰腺癌Panc-1细胞株构建成功。结论:通过慢病毒转染技术成功构建人胰腺癌Panc-1细胞B7-H3过表达稳定细胞株,为进一步研究B7-H3对胰腺癌的发生、发展的作用机制提供基础。第三部分B7-H3“逆向信号”在人胰腺癌细胞中的作用机制目的:进一步研究B7-H3介导的“逆向信号”对人胰腺癌细胞内信号转导的影响。方法:人胰腺癌Patu8988细胞经4H7刺激后,采用磷酸化蛋白纯化试剂盒提纯磷酸化总蛋白,采用Western Blot检测磷酸化B7-H3蛋白是否存在;Patu8988细胞经不同浓度的吉西他滨处理,各组细胞再分别用2.5μg/ml 4H7刺激,采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测各组细胞凋亡情况;Western Blot检测4H7刺激后的Patu8988细胞内Erk1/2、EGFR、Iκ-B蛋白的表达情况;利用下调B7-H3表达的Patu8988细胞株与上调B7-H3表达的Panc-1细胞株,Real-time PCR方法检测B7-H3与EGFR mRNA的相对表达情况,分别经不同浓度吉西他滨（Gemcitabine,GEM;4mmol/mL,8mmol/mL;48h,72h）处理,采用PI单染法检测各组细胞凋亡情况,并应用Western Blot检测各组细胞内相关信号蛋白的表达情况,包括B7-H3、Erk1/2、EGFR、Iκ-B以及Bcl-2家族相关凋亡蛋白。结果:Patu8988细胞经4H7刺激后,Western Blot检测出磷酸化B7-H3的存在,而在空白对照组并没有检测到磷酸化B7-H3蛋白,蛋白相对表达量分别为1.167±0.049、0,两者差异具有统计学意义（P<0.05）;B7-H3被激活后可以减少吉西他滨诱导的人胰腺癌细胞凋亡;当激发型抗体4H7浓度增加,Patu8988细胞内Erk1/2、EGFR蛋白的表达也相应增加,而Iκ-B蛋白的表达则出现相反的结果,两者之间存在统计学差异（P<0.05）;在Panc-1细胞组,当B7-H3上调后,EGFR mRNA的表达也相应增加;在Patu8988细胞组,当B7-H3下调后,EGFR mRNA的表达也相应减少,且两组实验结果均存在统计学差异（P<0.05）;B7-H3表达上调可使Panc-1细胞抵抗吉西他滨诱导凋亡的能力增强;在Panc-1细胞中,当B7-H3表达上调后,EGFR、Erk1/2蛋白也相应的表达增加,而Iκ-B蛋白的相对表达量则减少;同时,Panc-1细胞经吉西他滨处理后,也出现相似的结果;但Bcl-2、Bax、Bcl-x L蛋白并没有发现明显的改变,该结果在Patu8988细胞中则刚好相反。结论:1、B7-H3胞内段可以发生磷酸化从而将信号传导至细胞内;2、B7-H3可以通过上调EGFR的表达来影响人胰腺癌细胞内信号传导,进而影响胰腺癌的发生、发展;3、B7-H3可以通过“逆向信号”影响胰腺癌抵抗吉西他滨诱导的凋亡。