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背景和目的利用多柔比星(DOX)等化疗药物诱导肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)的化疗免疫治疗已成为十分有前景的肿瘤治疗方法。然而单独应用化疗药物存在很多局限性,如肿瘤内药物渗透性较差、诱导的免疫原性细胞死亡效应较弱等。本研究拟合成以透明质酸酶(HAase)修饰的负载DOX的中空介孔二氧化硅纳米粒子(DOX@HMSPHs)治疗肿瘤,以增加瘤内药物的渗透并增强肿瘤细胞免疫原性死亡,从而进一步激活特异性抗肿瘤免疫效应。方法1.通过化学方法依次合成中空介孔二氧化硅(HMSNs)、透明质酸酶功能化HMSN(HMSPHs)及负载DOX的纳米粒子(DOX@HMSPHs),并对其理化性质进行表征、对DOX的体外释放行为进行评估。在模拟肿瘤细胞外基质中,将黑素瘤细胞系B16/F10与透明质酸酶修饰前后纳米粒子HMSPs、HMSPHs共孵育,利用共聚焦显微镜观察不同时间点时细胞摄取纳米粒子的情况。2.在共聚焦显微镜下观察B16/F10细胞吞噬载药纳米粒子后,DOX在细胞内的分布情况。将载药纳米粒子与B16/F10细胞共孵育24 h后,用CCK-8试剂盒检测B16/F10细胞活性,以流式细胞术检测载药纳米粒子诱导B16/F10细胞的凋亡情况。进一步用流式细胞术、Western-Blot等方法检测载药纳米粒子作用后,B16/F10细胞释放包括CRT、HMGB1和ATP在内的损伤相关分子模式(DAMPs)的情况。将载药纳米粒子作用24 h后的B16/F10细胞与骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)共孵育24 h,用流式细胞术检测BMDCs表面CD86的表达,应用ELISA试剂盒检测BMDCs上清中IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌水平。此外,在荷B16/F10黑素瘤小鼠瘤内注射载药纳米粒子3天后,以流式细胞术检测肿瘤引流淋巴结(TDLNs)内CD11c~+CD86~+细胞的比例。3.构建荷B16/F10黑素瘤的C57BL/6小鼠肿瘤模型,瘤内注射载药纳米粒子治疗肿瘤,治疗的剂量为1.5 mg/kg DOX,隔天给药一次,共治疗四次,治疗过程中监测肿瘤生长情况。第20天终止实验,测量各治疗组小鼠的肿瘤体积及肿瘤重量,免疫荧光检测了瘤内透明质酸(HA)的表达,流式细胞术检测瘤内CD3~+CD8~+T细胞的比例。此外,进行疫苗接种实验,用不同药物组治疗24 h后的B16/F10细胞作为肿瘤疫苗,皮下注射到5周龄雌性C57BL/6小鼠的左背部。7天后,将未处理的B16/F10细胞重新接种到小鼠的右背部,连续观察小鼠右背部肿瘤生长情况。实验终止时,用流式细胞术检测右侧背部肿瘤内CD3~+CD8~+T细胞的比例,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-γ的水平。结果1.成功合成中空介孔二氧化硅(HMSNs),其粒径约为150-200 nm、壳层厚度约为30-40 nm,其比表面积和孔体积分别为884.5 m~2/g和0.65 cm~3/g,孔径为~2.9 nm。进一步合成透明质酸酶修饰的HMSPHs,透射电子显微镜下可清楚地观察到HAase成功包覆在了HMSNs上。在纳米粒子中负载DOX获得DOX@HMSPHs,DOX的包封率和载药量分别达到76.85±1.9%和8.44±0.19%。DOX@HMSPHs在pH=5.5的PBS中,DOX的8 h释放率可达到~70.9%,显著高于在pH=7.4时的DOX释放率(~31.2%)。在模拟肿瘤细胞外基质中,与无透明质酸酶修饰的HMSPs相比,在同一时间点有透明质酸酶修饰的HMSPHs被B16/F10细胞所摄取的数量明显增多。2.通过共聚焦显微镜观察到,与DOX@HMSPs组相比,用DOX@HMSPHs处理的B16/F10细胞中DOX的荧光强度显著升高。与PBS组相比,HMSPs和HMSPHs对B16/F10的细胞存活率无明显影响,而DOX、DOX@HMSPs和DOX@HMSPHs组处理24小时的B16/F10细胞存活率分别为63.2±9.5%,62.2±5.5%和49.0±2.1%。细胞凋亡实验结果表明,DOX@HMSPHs组细胞凋亡比例为67.6±4.4%,显著高于DOX@HMSPs组(55.0±2.8%)和DOX组(35.2±8.8%)。而纳米载体(HMSNs、HMSPs和HMSPHs)本身对正常小鼠成纤维细胞系NIH/3T3、人黑素瘤细胞系A375和小鼠黑素瘤细胞系B16/F10均无明显的细胞毒性作用。与DOX和DOX@HMSPs组相比,DOX@HMSPHs组诱导B16/F10细胞表面CRT阳性率显著升高、CRT的平均荧光强度显著增强,细胞上清液中的HMGB1及ATP分泌显著升高。与其他组相比,DOX@HMSPHs作用后的凋亡B16/F10诱导的CD86~+BMDCs的百分比显著升高,BMDCs上清液中IL-12p40、IL-6、IL-1β和TNF-α的水平亦显著提高。瘤内注射DOX@HMSPHs 3天后TDLNs CD11c~+CD86~+细胞百分比较其他组显著增加。3.与其他组相比,DOX@HMSPHs瘤内注射能够显著抑制B16/F10黑素瘤生长,并且能够降解瘤内HA,促进瘤内CD3~+CD8~+T细胞浸润。疫苗接种实验结果显示DOX@HMSPHs诱导的肿瘤疫苗能够延迟再移植肿瘤的生长,并促进再种植瘤内CD3~+CD8~+T细胞的浸润,提高小鼠血清中IFN-γ的水平。结论我们成功合成了DOX@HMSPHs载药纳米粒子,其表面的透明质酸酶可降解肿瘤细胞外基质中的透明质酸,增强纳米粒子的渗透性。从纳米载药系统中释放的DOX可诱导肿瘤细胞发生ICD并释放肿瘤相关抗原和DAMPs,从而促进树突状细胞的成熟,并进一步促进肿瘤浸润细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的活化,最终激活特异性抗肿瘤免疫。此外,纳米载体HMSPs可作为免疫佐剂,进一步提高DC识别肿瘤抗原并增强其抗原呈递能力,从而增强肿瘤浸润CTLs的活化。总之,我们的结果表明应用DOX@HMSPHs控释系统可能是一种增强ICD诱导的特异性肿瘤免疫的有效策略。