论文部分内容阅读
背景和目的慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）是指各种原因所致的胰实质和胰管的不可逆慢性炎症，其缓慢发展的病变最终可引起胰腺坏死、纤维化，腺泡和胰岛细胞萎缩消失，导致胰腺结构破坏和胰腺内、外分泌功能减退或丧失。其典型的病理表现为胰腺实质纤维化、腺泡细胞萎缩等，而胰腺纤维化的主要特征之一是大量纤维细胞增生和细胞外基质沉淀。在胰腺纤维化中，胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells,PSC）是参与胰腺纤维化的主要效应细胞。PSC分为静止和活化两种表现型。在未损伤的胰腺组织中PSC呈静止状态。胰腺受损时，在各种刺激因子的作用下使PSC活化，能产生Ⅰ型、Ⅲ型胶原及纤连蛋白等主要的细胞外基质，在胰腺纤维化中起重要作用。导致PSC活化的最重要的促纤维化因子转化生长因子和血小板衍生生长因子通过旁分泌激活PSC。因此，抑制PSC的活化和诱导其凋亡来抗胰腺纤维化成为可能。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是来源于骨髓支持结构的一群成体干细胞，其具有自我更新、多向分化能力和较强的增殖能力，在不同的条件下可分化为骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞和肝细胞样细胞等，是细胞治疗和基因工程的重要种子细胞。骨髓间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如白细胞介素、干细胞因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子、肝细胞生长因子及神经生长因子等。不仅能抑制胰腺炎症反应，还能阻止胰腺发生纤维化，减少纤维化的发生。IκBα的突变形式IκBαM则能与核转录因子-κB （Nuclear factor kappa B, NF-κB）发生不可逆性的结合形成三聚体以无活性的复合物形式存在于细胞胞质中。使NF-κB处以静息状态，从而起到抑制炎症反应和促进细胞凋亡的作用。因此，本实验通过转染入IκBαM基因的MSCs与PSC间接共培养，观察MSCs对PSC有无抑制作用，并探讨其机制是否与抑制炎症因子引起的炎症反应及抑制NF-κB的活性有关，从而产生抑制PSC的活化和促进其凋亡作用，为进一步进行体内试验提供理论基础和实验依据。全文分为两部分进行研究。材料与方法1.重组腺相关病毒IκBαM在骨髓间充质干细胞中的表达选择增殖旺盛期的MSCs按5×104个/孔接种入24孔板，共8孔，其中2孔留作细胞计数用。37℃5%CO2培养箱培养12h。观察细胞是否正常，计数细胞。用无血清的DMED培养液将细胞系两遍。按感染复数（Multiplicity of infection, MOI）值（v.g/cell）分别为2×104、1×105、5×105计算所需加入带有绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）IκBαM病毒的体积数，在试管中将需加入的rAAV-IκBαM病毒与无血清的DMEM培养液混合。将上述rAAV-IκBαM病毒与无血清的DMEM混合液分别加入每孔细胞中，每孔细胞加200μl。并作复孔。将24孔板置于37℃5%CO2培养箱培养。56h后，吸去每孔液体，加入1ml/孔含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续在37℃5%CO2培养箱培养。48h后，在荧光显微镜下观察MSCs是否发出绿色荧光，Western blot法检测IκBαM的表达。2.转染IκBαM骨髓间充质干细胞对胰腺星状细胞的体外调控以Transwell insert作为培养体系上层，接种骨髓间充质干细胞2×104个/孔，以培养板为培养体系下层，接种胰腺星状细胞2×104个/孔，建立上下双层细胞培养体系，IκBαM-MSCs与PSC共培养为A组（实验组），单纯MSCs与PSC共培养为B组（对照组），单纯培养的胰腺星状细胞为C组（空白组）。各组均常规培养。96h后ELISA法检测培养液中IL-1、IL-6、TNF-α和PDGF的浓度及细胞内NF-κBp65的浓度。流式细胞仪检测PSC的凋亡，PCR法检测凋亡基因BNIP3在PSC中的表达。结果1.重组腺相关病毒IκBαM在骨髓间充质干细胞中的表达1.1rAAV-IκBαM感染MSCs细胞48h后，在荧光显微镜下观察到GFP的表达。1.2Western blot检测结果显示rAAV-IκBαM转染组有IκBαM强阳性条带，rAAV-GFP转染组和未转染对照组为弱阳性条带。rAAV-IκBαM转染MSCs3d后在细胞裂解液中IκBαM含量明显高于rAAV-GFP转染组和对照组。2.转染IκBαM骨髓间充质干细胞对胰腺星状细胞的体外调控2.1在三组培养液中，与C组相比，A组和B组IL-1、IL-6、TNF-α、PDGF浓度均下降，差异有统计学意义（P﹤0.05）；A组、B组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。2.2在三组培养液中，与B组、C组相比，A组NF-κBp65浓度明显下降，差异有统计学意义（P﹤0.05）；B组、C组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。结论1．rAAV-IκBαM能高效的扩增，并且能有效的感染靶细胞MSCs，对MSCs的增殖生长无明显影响，能在MSCs细胞内稳定高水平的表达。2．转染IκBαM基因的MSCs可降低体外培养的PSC细胞培养基中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α和PDGF的水平，并能抑制PSC细胞内NF-κB的转录活性，具有抑制炎症反应和促进细胞凋亡的双重作用。