本单位以往研究发现:严重创伤后糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)功能受到严重抑制,使糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的抗炎作用受限;而核因子κB(NF-κB)功能显著活化,促进炎性细胞因子产生,因而产生了GR受抑制、NF-κB活化、炎性细胞因子释放增加的级联式放大效应,这与全身性炎症反应综合征(SIRS)的发生发展密切相关,进一步发展可能导致多器官功能不全综合症(MODS)发生。在此过程中,炎性因子释放增加对创伤后继发全身性损害的发生、发展起到了重要作用,如果能够有效控制炎性因子的产生,将会对机体的恢复产生积极作用。已有资料表明,GR和NF-κB都是多种炎性细胞因子的上游核转录因子,它们对炎性因子的产生起着相反的调控作用:GR具有显著的抗炎作用,能够抑制多种炎性因子(如IL-6、TNF-α等)的产生;而NF-κB具有明显的致炎作用,通过抑制NF-κB的活化,能显著抑制炎性因子的表达和释放。JAB1又名c-Jun结合蛋白(c-Jun-activation-domain binding protein 1),是38kD左右的可溶性核蛋白,是COP9信号体(COP9 signalosome regulatory complex)的第5个亚单位。JAB1能与多种蛋白相互作用,是多种蛋白的辅活化子,是一种重要的信号转导分子。国外有文献报道,JAB1是NF-κB的辅活化子,可上调其核转录功能。而本单位新近的研究中,通过酵母双杂交法筛选到多个与GR结合的分子,JAB1便是其中之一。随后又运用体外转录激活报告质粒分析系统对GR的转录激活能力进行了分析,证实JAB1能增强GR的转录激活活性,随着实验中JAB1表达的增强,GR的转录激活活性会显著增加。由此看来,JAB1有可能既是NF-κB的辅活化子,又是GR的辅活化子,但是它在炎症反应中究竟起到何种作用,目前尚未见明确报道。为此,本课题在海外青年学者合作研究项目的资助下,重点观察巨噬细胞低表达JAB1条件下对炎性细胞因子生成的影响,从而阐明JAB1在炎症反应中的作用。RNA干扰作为抑制特异基因表达的重要手段,可以简单、有效、特异的下调细胞中靶基因的表达,目前已经被广泛用于基因功能的实验研究中。为了探讨细胞受细菌内毒素(LPS)刺激后JAB1的主要功能,本课题以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为研究对象,通过RNA干扰抑制JAB1的表达,旨在观察在低表达JAB1条件下,细胞在LPS刺激时炎性细胞因子生成的变化。研究取得了如下结果:1成功构建重组质粒pPUR/U6-siJAB1选择小鼠JAB1基因(AF065386),根据siRNA序列选择的一般原则,结合网络信息,选定RNAi作用的靶序列。以靶序列为基础,设计并合成能在细胞内转录形成shRNA的寡核苷酸序列,并在两端引入ApaⅠ和EcoRⅠ酶切位点,寡核苷酸退火形成双链后与ApaⅠ和EcoRⅠ酶切的线性化质粒pPUR/U6定向连接,转化大肠杆菌DH5α。筛选后挑取阳性克隆,抽提的质粒经过酶切和测序鉴定,最终得到正确的重组质粒pPUR/U6-siJAB1。2低表达JAB1细胞克隆的筛选鉴定通过镜下直接观察和MTT法分析不同浓度嘌呤霉素对正常RAW264.7细胞的影响,最终确定用于转染后筛选的嘌呤霉素浓度为4ug/ml。转染试剂采用脂质体DOTAP,按常规方法操作,分别转染pPUR/U6质粒和pPUR/U6-siJAB1质粒,转染后24h开始加入嘌呤霉素对细胞进行筛选。约4周后得到稳定转染的细胞克隆,在维持嘌呤霉素筛选浓度不变的情况下逐步扩大培养,得到足量的细胞用于后续实验。收集各组细胞,提取总蛋白,用Western blot检测各组细胞的JAB1表达情况,结果显示:对照组与正常组相比,JAB1的表达差异并不显著,而干扰组的JAB1表达明显低于对照组与正常组,其JAB1表达量为正常组的29%,说明构建的JAB1基因干扰质粒在RAW264.7细胞中能够有效的抑制JAB1基因的表达,使JAB1蛋白的表达量显著下降,达到了预期的效果。3 JAB1低表达细胞在LPS刺激下生长速度和炎性因子的浓度变化用细胞计数的方法观察JAB1低表达细胞和正常细胞的生长情况,我们发现:在常规培养条件下,细胞的生长速度没有明显变化,细胞接种后约24h开始进入对数生长期;使用LPS刺激细胞后,在实验中的24h、48h和72h三个时相点均观察到JAB1低表达细胞的数量明显高于正常细胞数量,JAB1低表达细胞在24h后开始进入对数生长期,而正常细胞在此时的生长仍然受到明显的抑制,在48h后才进入对数生长期。说明JAB1低表达细胞对LPS刺激的耐受性较正常细胞高。ELISA检测LPS刺激后不同细胞培养上清中炎性因子TNF-α和IL-6的浓度,我们发现:在实验中的各个时相点,均观察到JAB1低表达细胞的培养上清中炎性因子浓度比正常细胞低。在TNF-α的检测结果中,两组细胞在6h、12h、24h、48h和72h时表现出了显著的差异;而在IL-6的检测结果中,JAB1低表达细胞在6h时几乎检测不到培养上清中的IL-6,而在12h、24h、48h和72h时表现出与正常细胞非常显著的差异。说明JAB1低表达细胞在LPS刺激后产生的炎性因子TNF-α和IL-6比正常细胞显著降低。结论1.成功构建了针对小鼠JAB1基因的RNAi表达载体,并在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中使JAB1蛋白表达量下调,其干扰效率为71%,为后续实验提供了低表达JAB1的细胞平台。2.本实验条件下,JAB1低表达细胞与正常细胞相比,在常规培养条件下生长速度没有明显差异;但在经过LPS刺激后,在实验中各个时相点的细胞数量均高于正常细胞,且正常细胞进入对数生长期的时间较JAB1低表达细胞延后。说明JAB1的低表达能提高细胞对LPS刺激的耐受性。3.本实验条件下,JAB1低表达细胞与正常细胞相比,在经过LPS刺激后产生的TNF-α和IL-6明显降低。说明JAB1的低表达能降低细胞经LPS刺激后产生的炎性因子TNF-α和IL-6浓度。JAB1是一种重要的信号转导分子,在多种生物学效应中起重要作用,它能够分别加强致炎因子和抗炎因子的活性。从本实验的初步结果推测:JAB1在LPS引起的炎症反应中对致炎因素的影响更大,但其具体作用机制还有待于进一步的深入研究。