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目的:探讨在常氧和低氧条件下IL-6是否经JAK2/STAT3通路上调人上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)细胞中HIF-1α的转录活性与表达,进而促进肿瘤缺氧耐受和肿瘤形成,为开展以IL-6及相关信号分子为靶点的EOC诊断及治疗提供新思路。方法:1.常规培养四种人卵巢癌细胞(A2780,SKOV3,ES-2,OVCAR3),分别抽提总RNA和蛋白,进行实时定量PCR反应和Western Blotting测定,前者检测STAT3及HIF-1αm RNA的表达水平,后者检测磷酸化/总STAT3及HIF-1α蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测上述四种卵巢癌细胞中IL-6的分泌水平。2.选择IL-6分泌水平具有显著差异的人卵巢癌细胞系A2780及SKOV3,分别应用不同浓度的IL-6(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)处理不同时间(6 h,12 h,24 h,48 h)后,抽提总RNA,进行定量q PCR反应,检测STAT3及HIF-1αm RNA的表达水平,用以确定外源性IL-6作用的最适浓度和最佳时间点。3.IL-6(10 ng/ml)、IL-6(50 ng/ml)分别作用于A2780及SKOV3细胞,处理不同时间(5 min,15 min,30 min,2 h,6 h,24 h,48 h)后,提取蛋白,进行Western Blotting实验,检测磷酸化/总STAT3及HIF-1α蛋白表达水平。此外,IL-6作用前加入JAK/STAT3通路的抑制剂AG490(50μM)预处理1h,再提取各组总RNA和蛋白,分别检测上述指标进行反向验证实验。4.在常氧(21%)、低氧(1%)或Co Cl2模拟低氧(A2780细胞:50μM,SKOV3细胞:100μM)条件下,外源性IL-6作用12 h,或应用脂质体法内源性过表达(ss)或抑制表达(as)IL-6,同时设立低氧(1%)或模拟低氧对照。分别抽提总RNA和蛋白,进行定量q PCR反应和Western Blotting检测,并检测STAT3及HIF-1αm RNA表达水平,和检测磷酸化/总STAT3及HIF-1α蛋白表达水平。5.使用荧光素酶报告基因检测常氧和低氧条件下IL-6对A2780、SKOV3细胞HIF-1α转录活性的影响。结果:1.实验结果显示,在四种人卵巢癌细胞株(A2780、SKOV3、OVCAR3和ES-2)中,IL-6、STAT3、HIF-1α三种分子均有不同程度的表达,其中IL-6在A2780细胞中几乎不表达,而在其余细胞株中表达较强,发现在SKOV3细胞中表达最强;经ELISA及Western Blotting检测发现,A2780细胞几乎不分泌IL-6,SKOV3细胞中IL-6分泌水平很高,进一步发现两种细胞中磷酸化的STAT3及HIF-1α的蛋白表达水平与IL-6分泌水平基本一致。综合上述结果,我们选取A2780细胞(不分泌IL-6)和SKOV3细胞(高分泌IL-6)作为本研究的细胞模型。2.使用不同浓度的IL-6(1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml)处理卵巢癌细胞不同的作用时间点(6 h、12 h、24 h),确定IL-6作用于A2780、SKOV3细胞最适浓度分别为50 ng/ml和10 ng/ml,结果表明经IL-6刺激后两种细胞中STAT3和HIF-1α基因表达水平显著增加。3.IL-6(50 ng/ml)作用于A2780细胞处理不同时间,发现在30min及12h,I L-6对磷酸化STAT3及HIF-1α的蛋白表达有明显的促进作用,而STAT3分子这一促进作用不明显;当IL-6作用于SKOV3细胞时,在12 h内,IL-6对磷酸化STAT3的表达有持续增强的作用,之后其表达水平下降,且HIF-1α与磷酸化STAT3的表达变化一致。通过观察上述结果,最终确定A2780,SKOV3细胞最适IL-6作用时间为12 h。4.常氧条件下,外源性加入IL-6或内源性转入IL-6可明显促进卵巢癌细胞中S TAT3及HIF-1αm RNA表达及磷酸化/总STAT3和HIF-1α蛋白表达,且这一增强作用可被AG490减弱。在低氧条件下,这一促进作用更加明显。上述结果表明,在常氧和低氧条件下,IL-6可能通过调节JAK/STAT3信号通路活化STAT3,最终促进卵巢癌细胞中HIF-1α的表达。5.常氧条件下,外源性加入IL-6或内源性转入IL-6,经荧光素酶报告基因检测发现,IL-6可明显增强卵巢癌细胞中HIF-1α转录活性,在单独低氧条件下,也有明显的促进作用,在低氧条件下,IL-6的促进作用更加显著。上述结果表明,IL-6和低氧单独作用都会明显增强EOC细胞HIF-1α的转录活性,且两者有一定的协同作用。结论:本研究通过人上皮性卵巢癌细胞株及前期工作获得的脂质体稳定转染的克隆筛选细胞株体外实验进行探讨,研究结果表明,常氧和低氧条件下,IL-6可通过激活JAK/STAT3通路调节卵巢癌细胞HIF-1α的表达及转录活性,为EOC诊断及治疗提供新的靶点和思路。