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胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）是胃肠激素，主要分泌于十二指肠和空肠，除了在外周发挥多种调节胃肠功能的作用，也见于脑内，在脑内作为神经传递介质发挥作用，因此，CCK也是一种脑肠肽。1973年，Gibbs实验室首次发现大鼠腹腔注射CCK-8导致大鼠摄食量明显减小，反应呈剂量依赖性，外周循环中CCK抑制食欲的作用已在不同种类的动物和人的研究中证实，外周注射CCK抑制食欲的作用是短暂的，使进食量减少但代偿性的进食次数增多，重复或长期应用CCK并不使体重减轻，CCK对食欲的作用通过CCK-1受体介导。然而，脑内CCK对摄食的作用及其机理尚不清楚。Blevin et al曾对大鼠脑内多部位直接注射CCK-8，诱导出短时间的摄食抑制，并证明作用部位主要为DMH和Arc。OLETF大鼠（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats）的CCK-1受体基因先天性缺失，表现为贪食，逐渐转为肥胖，最后出现2型糖尿病，对于OLETF大鼠的研究提示，CCK无论在外周还是在脑内的作用均对大鼠摄食控制中起抑制作用，进一步对于OLETF大鼠的研究发现，成年OLETF大鼠DMHNPY（神经肽Y）明显增高，CCK1受体缺失导致DMH NPY基因表达失调可能对OLETF大鼠肥胖和糖尿病的形成起作用。随之，免疫组化显示大鼠DMH的NPY神经元上具有CCK-1受体，提示下丘脑内CCK可能通过CCK-1受体介导作用于DMH的NPY神经元起作用，推测“DMH CCK—NPY”信号通路可能参与摄食控制。尽管如此，其确切的机理仍不明。本研究通过观察DMH核团内注射CCK对大鼠摄食的影响以及时间过程特点，检测DMH NPY基因、Arc NPY基因、Arc POMC基因和PVN CRF基因表达以及观察DMH核团内注射CCK后丘脑和脑干神经元激活的部位，探讨DMH注射CCK抑制摄食的特征以及相应的神经元活动的特征。方法：以成年Sprague-Dawley雄性大鼠（250～300g）为材料，置于20℃恒温环境，12h∶12h（明∶暗）的灯光周期中分笼饲养。1．清醒大鼠摄食实验：12只大鼠，实验组n=7，对照组n=6。大鼠麻醉后，按Paxinos-Watson图谱在下丘脑背内侧区（dorsal medial hypothalamus，DMH）插入套管，坐标为前囟后3.1 mm，旁开0.4 mm，颅骨表面下8.1 mm。一周后大鼠恢复良好，可进入实验。大鼠于手术恢复期时使其建立饮食规律：关灯前2小时禁食，随之22小时予以常规颗粒饲料。动物可自由饮水。实验组DMH核团微量注射CCK-8 500nmol／0.3ul，对照组DMH核团微量注射人工脑脊液（aCSF）0.3ul，人工脑脊液组成：(147mM Na+，2.7mM K+，1.2mMC Ca++，0.85mMMg++ and 153.8mMCl-)，注射于关灯前实施，注射后立即关灯，并给予食物，然后分别于注射后30min、1h、2h、4h、22h记录进食量。7天后，给予第二次DMH核团注射CCK-8和aCSF，实验组对照组交叉，注射时间和剂量以及进食量的记录同第一次。2．下丘脑NPY，CRF和POMC基因表达分析：摄食实验后，13只大鼠重新分组，实验组n=7，对照组n=6。DMH核团内注射CCK和aCSF步骤同前，注射后关灯但继续禁食，3小时后断头取脑，急速置于-80℃保存，待组织学检查套管位置和检测DMH NPY、Arc NPY、Arc POMC和PVN CRF的mRNA表达。大鼠前脑中部作14μm系列冠状切片贴于玻片上，以4％多聚甲醛固定。挑取PVN、DMH、Arc的切片，应用RNA原位核酸杂交，分别检测DMH NPY mRNA、Arc NPY mRNA和POMC mRNA、PVN CRF mRNA的表达。35S-cRNA探针以POMC、NPY和CRF cDNA为模板体外转录。切片以醋酸酐处理，酒精脱水后加杂交缓冲液(含35S-cRNA 6*108 cpm／μl)55℃过夜，杂交后清洗、脱水、干燥、曝光显影。放射自显影图象以NIH Scion Image软件进行定量分析。3．下丘脑和小脑c-FOS表达：28只雄性大鼠检测DMH注射CCK后下丘脑和小脑与摄食相关神经核中c-FOS细胞。大鼠分二组，每组14只，清醒状态下分别注射CCK-8和aCSF，剂量和方法同前。注射后立即禁食，90分钟后以戊巴比妥麻醉后，经心脏以PBS和4％多聚甲醛灌流，然后取脑置于4％多聚甲醛／25％蔗糖溶液中浸泡，4℃保存1-2天，在前脑中部和后脑作40μm系列冠状切片，包括下列部位：室旁核（paraventrical nucleus PVN）、视上核（supraoptic nucleus SON）、视交叉上suprachiasmatic neucleus SCh)、后交叉区retrochiasmatic area（RCh）、外侧下丘脑（lateral hypothalamus LH）、丘脑背内侧核（dorsomedial hypothalamic hypothalamic nucleus DMH）、丘脑腹内侧核（ventromedial hypothalamic nucleus VMH）、弓状核（arcuate nucleusArc）、后脑杏仁核（amygadala nucleus，CeA）、最后区（area postrema AP）、孤束核（nucleus of the solitary tract NTS）。c-FOS以免疫组织化学法检测，采用漂浮法，0.3％过氧化氢1h，羊血清包被1h，1∶10，000兔c-FOS抗体（Oncogene Science，SanDiego，CA）孵化过夜，生物素-羊抗兔血清1h，ABC复合试剂（Elite Vectastain Kit，Vector Labs，Burlingame，CA）1h，以二氨基联苯（DAB）显色。终止反应后，将组织切片贴到玻片上，干燥，酒精脱水后，显微镜下观察切片内套管轨迹和c-FOS表达，套管位置不正确者弃去。c-FOS阳性细胞定量以自动图象分析软件处理（IpLab，Scanalytics，Fairfax，VA），除DMH分别计数注射侧和注射对侧，其余部位均计数脑二侧，在每个部位均读取2～3张切片，取平均值，神经解剖学定位参照Paxinos-Watson图谱。4．统计学检验：结果采用均数±标准误，均数t检验统计学处理，P＜0.05说明有统计学意义。结果1．DMH注射CCK对大鼠摄食的影响500nmol CCK-8直接注射到DMH后，大鼠在注射后的0.5h，1h，2h，4h，22h内的累计摄食量均较对照组显著减少，比较0～0.5h，0.5-1h，1～2h，2～4h，4～22h各个时间段的摄食量，发现在0.5h内和2～4h时间段实验组较对照组摄食量显著减少，其余无显著差异。2．DMH CCK注射后神经肽表达的变化实验组动物在DMH的NPYmRNA表达较对照组降低27％，Arc的NPYmRNA表达较对照组降低24％；实验组PVN的CRFmRNA表达增高38％；而POMCmRNA在Arc表达二组未见显著差异。3．DMH CCK注射对下丘脑和小脑尾部与摄食控制相关部位c-FOS蛋白激活的影响实验组在下丘脑DMH、Arc、PVN、SCh、RCh上c-Fos表达明显高于对照组，在SON、LH、VMH、ME上二组无显著差异，在脑干NTS、AP上未见c-Fos表达。注射侧的DMH无论实验组还是对照组可见非常强烈的c-FOS表达，但二者比较未见显著性差异，比较二组注射对侧DMH的c-FOS阳性细胞数，实验组明显较对照组增高。ArC上c-FOS激活较对照组明显，主要见于内侧Arc。PVN上c-FOS表达显著增加主要见于小细胞PVN上。结论DMH CCK具有摄食抑制作用，与外周CCK作用短暂不同，DMH CCK作用持续时间较长；DMH CCK作用于NPY神经元抑制NPY基因表达而发挥摄食抑制的作用，并上调PVN CRF基因表达，DMH CCK抑制Arc NPY基因表达，但不影响Arc POMC基因表达；DMH CCK增加可激活下丘多个神经元如PVN，Arc，cDMH，RCh，SCh等，与外周CCK不同，DMH CCK不引起NTS和AP的神经元活动。上述结果表明，DMH CCK-NPY信号系统在控制摄食和能量代谢平衡中发挥重要作用，下丘脑多条依赖PVN CRF和Arc NPY的神经信号途径介导其作用。