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目的：免疫紊乱是导致胰腺炎患者转向重症甚至死亡的重要原因，因此免疫调控时机成为SAP治疗的重大问题。作为治疗SAP最常用的中药大黄对于不同免疫状态下的SAP均能应用吗？前期研究发现肠粘膜免疫系统在SAP的免疫紊乱中发挥重要作用，本研究拟动态观察肠粘膜免疫系统致炎/抗炎因子、免疫细胞数量、体液免疫因子等变化情况，观察SAP大鼠的免疫动力学变化。在此基础上评估不同免疫状态下给予大黄及大黄游离蒽醌(FTRAs）的药效差异，确定最佳用药时机。接下来注射亚致死剂量铜绿假单胞菌模拟继发感染，验证最佳用药时机的保护作用。
方法：（1）SAP免疫动力学变化：①3.5%牛磺胆酸钠（NaTc）制备SAP大鼠模型，观察大鼠14天存活率以及1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、120h、168h和336h胰腺大体情况，HE染色观察胰腺病理变化，血清淀粉酶和胰腺脂肪酶活力水平评价SAP严重程度。②通过HE染色观察小肠病理变化，ELISA法检测血清D-乳酸水平反映肠道黏膜屏障功能。③ELISA法检测小肠匀浆IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18（致炎因子），TGF-β、IL-10、IL-4、sTNF-αR（抗炎因子）的水平，鲎试剂定量法检测血浆内毒素水平反映SAP肠道炎症变化规律。④通过HE染色法观察肠系膜淋巴结（MLN）病理变化，免疫组化法检测小肠CD68和C103表达反映肠巨噬细胞和树突状细胞数量，流式细胞术检测肠系膜淋巴结中Th1、Th2、Treg细胞的变化，ELISA法检测肠匀浆中SIgA的含量反映SAP大鼠体液免疫变化。⑤SAP免疫转折时间点的确定：测定铜绿假单胞菌（PA）生长曲线，确定对数生长期。正常大鼠注射不同剂量PA，观察7天死亡率，筛选亚致死剂量PA。ELISA检测正常大鼠接受亚致死剂量PA攻击后0h、2h、4h、6h和12h的IL-1β和TNF-α的变化，筛选最佳取材时间点。ELISA检测SAP建立后0h、12h、24h、36h、48h给予亚致死量PA攻击大鼠肠道TNF-α和IL-1β水平变化，确定免疫转折点。（2）研究FTRAs对不同免疫状态SAP的治疗作用。设假手术组（Sham组），模型组（SAP），SAP+生大黄组（阳性对照组），SAP+FTRAs（22.5mg/kg，45mg/kg，90mg/kg治疗组，）在SAP免疫转折前（0h）、中（48h）、后（72h）给药，12h/次，共3次，末次给药2h后，即造模后24h、72h、96h处死取材。检测指标同第一部分。（3）研究FTRAs对SAP大鼠继发PA感染的保护作用，设Sham组，SAP组，Sham+PA组，SAP+PA组，SAP+生大黄+PA，SAP+FTRAs（22.5mg/kg，45mg/kg，90mg/kg）+PA，观察大鼠7天死亡率，ELISA法检测肠IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18（致炎因子）和TGF-β、IL-10、IL-4、sTNF-α（抗炎因子）的水平，鲎试剂定量检测血浆内毒素的水平。
结果：（1）SAP免疫动力学变化：①SAP大鼠14天累积存活率为61.08%，48h以前和48h以后分别为SAP两个死亡高峰；胰腺大体术后1-6h充血坏死，12h后胰腺开始硬化变黄，与肝脏、肠道等器官粘连；胰腺病理在6-48h组织溶解性坏死，炎性细胞浸润，72-336h出现纤维增生和肉芽组织形成。与Sham组相比，血清淀粉酶活力1-6h逐渐增加，6h到达高峰，6-36h基本保持不变，36h后逐渐降低；胰腺脂肪酶活力在3-12h升高达到高峰期，随后逐渐降低。②SAP组从12h开始，肠道黏膜萎缩，固有层炎性细胞浸润，肠道通透性增加；与Sham组相比，血清D-乳酸从12h开始逐渐增加，48h到达高峰，48-120h基本保持不变，120-336h略微下降。③与Sham组相比，SAP组大鼠肠道IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、TGF-β、IL-10和血浆内毒素主要在12-48h明显升高，48h后开始逐渐下降；IL-4和sTNF-αR在6-36h明显下降，36h后逐渐上升。④肠系膜淋巴结在3-336h病理改变明显，淋巴结淋巴滤泡明显增多，病理评分在3-12h逐渐上升，12-36h处于平台期，36-336h病理评分略微下降。与Sham组相比，SAP组大鼠在1-6h肠道CD68表达略微增加，在12-72h表达明显降低，120-336h逐渐上升。SAP组大鼠在1-3h肠道CD103的表达逐渐增加且聚集于绒毛上端，6-72h肠道CD103表达明显降低，120-336h逐渐上升。与Sham组相比，SAP组肠系膜淋巴结Th1比例在1-24h逐渐增加，24-36h处于平台期，36h开始逐渐下降，72h降至正常水平。Th2比例在1-36h无明显变化，36h开始下降，36-336h处于平台期。与Sham组相比，Th1/Th2比值在1-3h无明显变化，6-24h比值逐渐增大，24h到达高峰，然后24-336h比值逐渐下降。与Sham组相比，SAP组肠系膜淋巴结Treg细胞比例在1-6h无明显变化，在12-24h逐渐升高，24h达到高峰，24-48h处于平台期，然后48-168h开始逐渐下降，168h恢复至正常水平。与Sham组相比，SAP大鼠肠道体液免疫因子SIgA含量从1h开始逐渐降低，3h达到低谷，3-36h处于低水平平台期，36-48h逐渐上升，48h恢复至正常水平，48-336h肠道SIgA含量基本保持不变。⑤观测铜绿假单胞菌（PA）生长曲线，发现培养16h后为PA对数生长期；2.0×108CFU/kg PA为亚致死剂量；与对照组相比，PA攻击后，肠道IL-1β和TNF-α水平在2h到达高峰，随后降低，2h为PA攻击后最佳取材时间。在SAP造模后给予亚致死量PA，与SAP组相比，SAP+PA组在0h、12h、24h、36h大鼠肠道IL-1β和TNF-α略微增加，但在48h，与SAP组相比，SAP+PA组IL-1β和TNF-α略微降低，因此确定48h是SAP大鼠从前期过度炎症反应和混合型免疫时期转折到代偿性免疫抑制时期的转折点。（2）FTRAs对不同免疫状态SAP的治疗作用：①在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组胰腺坏死区域减少，胰腺损伤减轻。在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能够抑制SAP血清淀粉酶和胰腺脂肪酶的活性。在免疫转折中和免疫转折后给药无明显影响。②通过肠道病理观察，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能减轻肠道上皮细胞的脱落，减轻肠道损伤，而在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能够降低血清D-乳酸的水平，而在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。③在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能降低肠道IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、TGF-β、IL-10和血浆内毒素的含量，增加IL-4和sTNF-αR的水平。在免疫转折中给药，与SAP-72h组相比，SAP+FTRAs（90mg/kg）-72h组能够显著降低TNF-α、IL-18、TGF-β的水平，对IL-1β、IL-6、IL-8、ET、IL-10、IL-4、sTNF-αR无明显作用。在免疫转折后给药，与SAP-96h组相比，SAP+FTRAs（90mg/kg）-96h组能够显著降低IL-18，对IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、ET、TGF-β、IL-10、IL-4和sTNF-αR无明显作用。
结论：（1）建模后48h是SAP大鼠从前期过度炎症反应和混合型免疫时期转折到代偿性免疫抑制时期的转折点。（2）FTRAs在SAP免疫转折前给药能够有效抑制机体炎症反应，为最佳给药时机。（3）通过FTRAs在免疫转折前给药，能够保护SAP免疫转折后继发PA感染，进一步明确最佳给药时机。
方法：（1）SAP免疫动力学变化：①3.5%牛磺胆酸钠（NaTc）制备SAP大鼠模型，观察大鼠14天存活率以及1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、120h、168h和336h胰腺大体情况，HE染色观察胰腺病理变化，血清淀粉酶和胰腺脂肪酶活力水平评价SAP严重程度。②通过HE染色观察小肠病理变化，ELISA法检测血清D-乳酸水平反映肠道黏膜屏障功能。③ELISA法检测小肠匀浆IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18（致炎因子），TGF-β、IL-10、IL-4、sTNF-αR（抗炎因子）的水平，鲎试剂定量法检测血浆内毒素水平反映SAP肠道炎症变化规律。④通过HE染色法观察肠系膜淋巴结（MLN）病理变化，免疫组化法检测小肠CD68和C103表达反映肠巨噬细胞和树突状细胞数量，流式细胞术检测肠系膜淋巴结中Th1、Th2、Treg细胞的变化，ELISA法检测肠匀浆中SIgA的含量反映SAP大鼠体液免疫变化。⑤SAP免疫转折时间点的确定：测定铜绿假单胞菌（PA）生长曲线，确定对数生长期。正常大鼠注射不同剂量PA，观察7天死亡率，筛选亚致死剂量PA。ELISA检测正常大鼠接受亚致死剂量PA攻击后0h、2h、4h、6h和12h的IL-1β和TNF-α的变化，筛选最佳取材时间点。ELISA检测SAP建立后0h、12h、24h、36h、48h给予亚致死量PA攻击大鼠肠道TNF-α和IL-1β水平变化，确定免疫转折点。（2）研究FTRAs对不同免疫状态SAP的治疗作用。设假手术组（Sham组），模型组（SAP），SAP+生大黄组（阳性对照组），SAP+FTRAs（22.5mg/kg，45mg/kg，90mg/kg治疗组，）在SAP免疫转折前（0h）、中（48h）、后（72h）给药，12h/次，共3次，末次给药2h后，即造模后24h、72h、96h处死取材。检测指标同第一部分。（3）研究FTRAs对SAP大鼠继发PA感染的保护作用，设Sham组，SAP组，Sham+PA组，SAP+PA组，SAP+生大黄+PA，SAP+FTRAs（22.5mg/kg，45mg/kg，90mg/kg）+PA，观察大鼠7天死亡率，ELISA法检测肠IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18（致炎因子）和TGF-β、IL-10、IL-4、sTNF-α（抗炎因子）的水平，鲎试剂定量检测血浆内毒素的水平。
结果：（1）SAP免疫动力学变化：①SAP大鼠14天累积存活率为61.08%，48h以前和48h以后分别为SAP两个死亡高峰；胰腺大体术后1-6h充血坏死，12h后胰腺开始硬化变黄，与肝脏、肠道等器官粘连；胰腺病理在6-48h组织溶解性坏死，炎性细胞浸润，72-336h出现纤维增生和肉芽组织形成。与Sham组相比，血清淀粉酶活力1-6h逐渐增加，6h到达高峰，6-36h基本保持不变，36h后逐渐降低；胰腺脂肪酶活力在3-12h升高达到高峰期，随后逐渐降低。②SAP组从12h开始，肠道黏膜萎缩，固有层炎性细胞浸润，肠道通透性增加；与Sham组相比，血清D-乳酸从12h开始逐渐增加，48h到达高峰，48-120h基本保持不变，120-336h略微下降。③与Sham组相比，SAP组大鼠肠道IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、TGF-β、IL-10和血浆内毒素主要在12-48h明显升高，48h后开始逐渐下降；IL-4和sTNF-αR在6-36h明显下降，36h后逐渐上升。④肠系膜淋巴结在3-336h病理改变明显，淋巴结淋巴滤泡明显增多，病理评分在3-12h逐渐上升，12-36h处于平台期，36-336h病理评分略微下降。与Sham组相比，SAP组大鼠在1-6h肠道CD68表达略微增加，在12-72h表达明显降低，120-336h逐渐上升。SAP组大鼠在1-3h肠道CD103的表达逐渐增加且聚集于绒毛上端，6-72h肠道CD103表达明显降低，120-336h逐渐上升。与Sham组相比，SAP组肠系膜淋巴结Th1比例在1-24h逐渐增加，24-36h处于平台期，36h开始逐渐下降，72h降至正常水平。Th2比例在1-36h无明显变化，36h开始下降，36-336h处于平台期。与Sham组相比，Th1/Th2比值在1-3h无明显变化，6-24h比值逐渐增大，24h到达高峰，然后24-336h比值逐渐下降。与Sham组相比，SAP组肠系膜淋巴结Treg细胞比例在1-6h无明显变化，在12-24h逐渐升高，24h达到高峰，24-48h处于平台期，然后48-168h开始逐渐下降，168h恢复至正常水平。与Sham组相比，SAP大鼠肠道体液免疫因子SIgA含量从1h开始逐渐降低，3h达到低谷，3-36h处于低水平平台期，36-48h逐渐上升，48h恢复至正常水平，48-336h肠道SIgA含量基本保持不变。⑤观测铜绿假单胞菌（PA）生长曲线，发现培养16h后为PA对数生长期；2.0×108CFU/kg PA为亚致死剂量；与对照组相比，PA攻击后，肠道IL-1β和TNF-α水平在2h到达高峰，随后降低，2h为PA攻击后最佳取材时间。在SAP造模后给予亚致死量PA，与SAP组相比，SAP+PA组在0h、12h、24h、36h大鼠肠道IL-1β和TNF-α略微增加，但在48h，与SAP组相比，SAP+PA组IL-1β和TNF-α略微降低，因此确定48h是SAP大鼠从前期过度炎症反应和混合型免疫时期转折到代偿性免疫抑制时期的转折点。（2）FTRAs对不同免疫状态SAP的治疗作用：①在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组胰腺坏死区域减少，胰腺损伤减轻。在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能够抑制SAP血清淀粉酶和胰腺脂肪酶的活性。在免疫转折中和免疫转折后给药无明显影响。②通过肠道病理观察，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能减轻肠道上皮细胞的脱落，减轻肠道损伤，而在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能够降低血清D-乳酸的水平，而在免疫转折中和免疫转折后给药，FTRAs无明显作用。③在免疫转折前给药，与SAP-24h组相比，SAP+FTRAs（45mg/kg，90mg/kg）-24h组能降低肠道IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-18、TGF-β、IL-10和血浆内毒素的含量，增加IL-4和sTNF-αR的水平。在免疫转折中给药，与SAP-72h组相比，SAP+FTRAs（90mg/kg）-72h组能够显著降低TNF-α、IL-18、TGF-β的水平，对IL-1β、IL-6、IL-8、ET、IL-10、IL-4、sTNF-αR无明显作用。在免疫转折后给药，与SAP-96h组相比，SAP+FTRAs（90mg/kg）-96h组能够显著降低IL-18，对IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、ET、TGF-β、IL-10、IL-4和sTNF-αR无明显作用。
结论：（1）建模后48h是SAP大鼠从前期过度炎症反应和混合型免疫时期转折到代偿性免疫抑制时期的转折点。（2）FTRAs在SAP免疫转折前给药能够有效抑制机体炎症反应，为最佳给药时机。（3）通过FTRAs在免疫转折前给药，能够保护SAP免疫转折后继发PA感染，进一步明确最佳给药时机。