研究背景和目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤,是全球第四大癌症相关死亡原因。HCC诊断时多已进展到晚期,治疗手段有限,死亡率高,因此早期诊断对于提高患者生存率起到至关重要的作用。HCC多为富血供肿瘤,肿瘤新生血管表面高表达某些特异性分子如Endoglin。Endoglin,又称CD105,它是转化生长因子β（TGF-β）受体复合物的主要组成部分,其主要功能是参与新生血管的生成,可以作为肿瘤血管新生标志物。近年来,超声分子显像为表征和评价体内生命过程提供了一种方便和无创的技术方法。在肿瘤生长的背景下,超声分子显像能够检测出肿瘤微血管生成和评价抗血管生成治疗效果。已有研究发现,靶向超声微泡可以与某些高表达血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR-2）、整合素α v β 3（Integrin α v β 3）等靶点结合,超声造影出现显著增强信号,与对照组有明显差异。迄今为止,尚未见到利用HCC特异性靶向Endoglin成像诊断HCC的报道。本研究设想将超声微泡与Endoglin单克隆抗体混合制备的靶向造影剂注射到荷HepG2裸鼠体内,测定其与肿瘤微血管内皮细胞上特异性靶点的结合,旨在通过非线性谐波超声显像测定肿瘤新生血管的生成来诊断HCC的形成。为进一步证实Endoglin在肿瘤内的高表达,本研究利用蛋白质印记法、逆转录-定量聚合酶链反应、免疫组织化学以及HepG2细胞条件培养液孵育人脐静脉内皮细胞等方法进行了验证。研究方法:1.靶向微泡制备及特性检验:在微泡瓶中加入1ml生理盐水震荡混匀,在室温条件下,将100 μg生物素化Endoglin抗体CD105、100μg同型对照IgG抗体分别与1支微泡混匀孵育10min,置于4℃冰箱保存备用。采用FITC-Annexin V/PI法评价人脐静脉内皮细胞与微泡孵育12h后活细胞比率评估微泡-抗体复合物细胞毒性。生物素-FITC双标记的抗体CD105和IgG与靶向微泡结合,检测抗体与微泡的结合效率。2.实验模型的制备:选取4只3-4周龄、体重22-25g的BALB/c雄性裸鼠,在无菌环境中进行饲养。室温20℃-22℃下,将培养好的HepG2细胞约5×106个悬于0.2ml无菌PBS溶液,注射在裸鼠右侧背部皮下,3周后观察肿瘤生长情况,在最大直径为0.5cm左右时,适合做超声分子显像。3.超声分子显像:本研究应用Visualsonic公司生产的Vevo 2100小动物高分辨率超声系统对荷HepG2的裸鼠皮下移植肿瘤内Endogl in特异性靶向微泡分布情况进行了观察,通过瞬间爆破前后探查区域声波强度的变化差值来间接反映肿瘤微血管的生成。微泡制备根据制造商提供的说明书操作,超声系统的使用按照Visualsonic公司的《小动物非线性超声造影成像指南》操作。通过裸鼠尾静脉注入2×108（约0.1ml）混匀的同型对照微泡,同时超声进入造影模式,记录下微泡进入体内及肿瘤内微血管血流灌注过程。随后,启动一个高功率的破坏性脉冲程序（机械指数0.59,中心频率10MHz）对超声观察区域中的所有微泡进行了1秒的破坏,同时采集超声图像来评价微气泡循环补充的程度。30min后,待循环中所有微泡都已经完全代谢清除之后,再次经尾静脉注入Endoglin靶向微泡2×108个（约0.1ml）同时超声进入造影模式,记录下微泡进入体内及肿瘤内微血管血流灌注过程,余同上述步骤,机载软件自动计算出表示结合微泡信号强度差异的量化指标ATE,该值越大代表探测区域结合于靶点的微泡数量越多。4.RT-qPCR、Western blotting、免疫组织化学染色方法检测裸鼠肝脏和HepG2移植肿瘤组织内Endogl in的表达。5.HepG2条件培养基细胞培养检测人脐静脉内皮细胞中Endoglin的表达。6.统计分析:采用非配对样本student-t检验评估统计学显着性。所有统计分析均采用SPSS17.0统计软件自动分析。P值<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.FITC-Annexin V/PI法检测细胞毒性结果显示,Endoglin抗体微泡组、同型对照微泡组活细胞比率与对照组相比差异无统计学意义。2.微泡-CD105体外结合能力测定:荧光显微镜下显示,裸微泡与抗体不结合,荧光亮度随着CD105浓度的升高而增强,当CD105抗体浓度在40ug时与微泡结合率最高,微泡绿色荧光最强,微泡结合阳性率为81.1%。3.超声分子显像:所有实验动物均可良好耐受超声造影麻醉及检查,全程无急性毒性反应。本研究结果显示,MBEndoglin爆破前后信号的差值ATE值高于同型对照MBIsotype,两组间差异有统计学意义（P<0.001）。4.Endoglin在裸鼠肝组织和HepG2移植肿瘤组织内的表达:本研究采用免疫组织化学、RT-qPCR和Western blotting分析方法,对实验裸鼠肝脏和HepG2移植瘤内的Endogl in表达情况进行分析。Endogl in在正常肝组织和血管的微血管内皮上不表达,但在HepG2移植肿瘤中过度表达。RT-qPCR分析显示,HepG2肿瘤组织内Endoglin RNA表达显著高于裸鼠肝组织（n=4;P<0.001）。Western blotting分析检测Endoglin的表达,在HepG2肿瘤的蛋白提取液中存在Endoglin,而在裸鼠肝组织中则未见Endogl in的表达。5.HepG2条件培养基细胞培养检测人脐静脉内皮细胞中Endoglin的表达:在体外培养的内皮细胞中,细胞在增殖和活化过程中可检测到较高的Endoglin表达。为模拟肿瘤血管的微环境,收集HepG2细胞条件培养基,应用于HUVECs培养。在HepG2条件培养基中培养12h后,HUVECs内Endoglin mRNA水平显著升高（P<0.001）。提取HUVECs中的总蛋白,用Western blotting法检测Endoglin的表达。HepG2条件培养液处理的HUVECs内Endoglin水平显著高于对照组（P<0.001）。结论:1、Endoglin可以作为肝细胞肝癌特异性的靶点。2、Endoglin特异性靶向超声造影剂可以有效与动物模型中的靶点结合,并且安全无明显毒性反应,有可能成为早期诊断肝脏恶性肿瘤的新方法。