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丙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染性疾病。全球大约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV),HCV感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝细胞癌的重要原因之一。目前治疗HCV主要是通过α-干扰素(interferon-α,IFN-α)与病毒唑的组合疗法,但疗效低,仅有45%左右,而且副作用大。至今还没有有效的疫苗。HCV复制细胞培养体系的成功建立,为体外研究HCV的复制机制,抗病毒药物的筛选提供了有效的工具。然而HCV复制模型不能产生感染性的病毒颗粒,不适用于HCV感染机制的研究。与此同时,缺乏有效的HCV小动物模型严重阻碍了HCV致病机制的研究、抗HCV药物体内作用效果的评价和保护性疫苗的研发。因此,探索建立有效的HCV模型,包括HCV复制的小动物模型和感染细胞体系,具有十分重要的意义。对此,本课题在引进HCV复制子和全基因组感染克隆的基础上,建立并完善报告基因标记的HCV亚基因组复制细胞和裸鼠移植模型,并用报告基因对HCV全基因组进行标记,建立了报告基因标记的HCV全基因组细胞感染体系,为HCV致病机制的研究和抗病毒药物的评价奠定基础。具体研究内容和结果如下:1.以荧光素酶(luciferase,Luc)标记的HCV复制子质粒pFKI389LucUbiNeoNS3- 3’/5.1为模板,体外转录获得RNA,电转至Huh7细胞,G418加压筛选得到阳性HCV复制细胞。结果显示筛选到的阳性细胞具有很高的荧光素酶活性,间接免疫荧光检测到HCV NS5A蛋白的表达,表明已经建立了荧光素酶标记的HCV亚基因组复制细胞模型。进而用不同浓度α-干扰素-2b(α-IFN-2b)处理复制子细胞,72h内荧光素酶的活性呈剂量依赖性下降,反应出HCV的复制水平受到α-IFN-2b不同程度的抑制,从而证明了在细胞水平上该模型用于药物评价的可行性。在此基础上,把荧光素酶标记的HCV复制细胞移植至Balb/c裸鼠皮下,建立了荧光素酶标记的HCV复制细胞皮下移植裸鼠模型。活体荧光成像实时检测到HCV在裸鼠体内复制,而且证实α-IFN-2b能显著抑制HCV在体内的复制水平。上述结果表明,我们所建立的荧光素酶标记的HCV亚基因组复制细胞模型和移植裸鼠模型可以用于抗HCV药物的筛选和评价。2.以HCV全基因组感染克隆pFL-J6JFH1为基础,将GFP(green fluorescence protein)插入到HCV 2394aa(amino acid)处,构建了GFP标记的HCV全基因组质粒pFL-J6JFH1-GFP。将体外转录获得的pFL-J6JFH1-GFP RNA转染Huh7.5细胞后,间接免疫荧光检测到转染细胞中HCV NS5A蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察到GFP的表达,荧光定量PCR测定其培养上清中含有高达3.5×107copies/ml的病毒RNA。经α-IFN-2b处理72 h后,绿色荧光明显减弱。上述结果表明初步建立了GFP标记的HCV全基因组感染细胞模型。3.将体外转录获得的Luc-JC1 RNA转染至Huh7.5细胞,间接免疫荧光检测到转染细胞中HCV NS5A蛋白的表达,并利用活体荧光成像观察到了转染Luc-JC1 RNA的Huh7.5细胞内Luc的表达,荧光定量PCR测定其培养上清中含有高达3.3×106 copies/ml的病毒RNA。表明初步建立了Luc标记的HCV全基因组感染细胞模型。4.将质粒pJFH1转染Huh7.5细胞,Blasticidin抗性筛选得到JFH1 HCV全基因组稳定转染细胞模型。间接免疫荧光和Western Blot分别检测到HCV NS5A和core蛋白的表达;荧光定量PCR连续监测培养上清中病毒RNA,转染80d后其水平仍然维持在106copies/ml,显示出该模型具有较好的稳定性。综上所述,本研究引进HCV复制子和全基因组感染克隆的基础上,初步建立了荧光素酶标记的HCV亚基因组复制皮下移植裸鼠模型,GFP标记的HCV全基因组感染细胞模型,Luc标记的HCV全基因组细胞感染模型和JFH1 HCV全基因组稳定转染细胞模型,为进一步进行HCV致病机制的研究和抗HCV药物的研发提供有利的工具。