媒介昆虫对杀虫剂的抗性是虫媒病控制中一个亟待解决的突出问题，媒介抗性治理有赖于抗性机制的理解。研究表明，抗性产生是由基因决定的。就目前广泛使用的菊酯类杀虫剂，其抗性机制主要涉及代谢酶类如细胞色素P450(CYP450)等。 本研究根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计简并引物，在选育淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系的基础上，运用RT-PCR方法从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系四龄幼虫RNA中扩增出9条新的EST基因片段：半定量PCR检测其在抗性和敏感品系中的差异表达；通过基因重组方法，构建原核表达载体，进行原核表达和鉴定。初步探讨了CYP4基因的诱导表达和鉴定，为后续研究CYP4基因在淡色库蚊抗性中的作用、媒介抗性的分子机理和特异性抗体开发奠定基础。 1．淡色库蚊CYP4家族新成员基因克隆及序列分析 根据GenBank中的昆虫P450氨基酸保守序列和Scott等报告的P450引物设计1对简并引物，运用RT-PCR方法从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系四龄幼虫RNA中扩增P450特异性基因片段，PCR产物克隆入pGEM-T easy载体，基因测序并与GenBank EST库比对，进行序列分析。 结果：获得约500bp大小片段，进行2次克隆后，挑取9个阳性克隆送测序。结果表明均为CYP450，具有不同序列，分子量在483～497bp范围内，编码162～166个氨基酸，蛋白理论分子量为17.8～18.3KD。9个cDNA片段经与GenBank资料比较，显示均为新序列，由GenBank的dbEST库收录(accession numbers：CB074944-074951和CB270837，2003)。进一步将9个新序列递呈国际细胞色素P450命名委员会，被鉴定分别属于CYP4家族的CYP4H、CYP4J和CYP4E亚家族(CYP4J8V2，CYP4J8V3，CYP4E2r6，CYP4E6，CYP4H12V4，CYP4H12V5，CYP4H21V2，CYP21V3，CYP4H22V3)。使用CLUSTALW软件对这些CYP4进行氨基酸同源性比对，经蛋白质结构分析和功能预测，其均为胞浆蛋白。南京医科大学硕十学位论交2.淡色库蚊CYP4新序列与澳氰菊醋才朴胜关系的初步鉴定 采用半定量PCR方法，以日一actill为内参照，检测敏感品系和抗性品系RNA中9个CYP4新基因的转录水平。 结果:在相同PCR条件下，通过调节电泳分析中PCR产物的量，使日一aCtin扩增带在敏感品系和抗性品系中等量表达，此时CYP4EZr6基因在抗性品系中差异性高表达，其它8个基因未见到明显的表达差异，提示CYP4EZr6基因可能与淡色库蚊抗性相关，值得进一步研究。3.淡色库蚊cYP4EZr6基因的原核表达及鉴定 运用PCR方法扩增出CYP4EZr6基因，通过基因重组方法，构建pGex一6PI/CYP4EZr6原核表达载体，带，」备了多克隆抗家蝇P450抗体，对CYP4EZr6基因的原核蛋白表达进行了初步鉴定。3一eYP4EZr6基因原核表达载体的构建 设计表达引物，通过PCR方法从淡色库蚊澳氰菊醋抗性品系四龄幼虫CYP耳基因保种菌液中，获取CYP4EZr6基因。PCR产物克隆入pGEM一T easy载体，通过PCR、双酶切和基因测序方法鉴定。小量抽提重组质粒，用双酶切切下目的基因片段。按照一定比例在T4洲A链接醚洲乍用下，与纯化的表达质粒进行基因重组，鉴定重组表达质粒。 结果:基因测序表明，所扩增基因为目的基因，引物设计酶切位点正确。重组表达质粒用基因特异性引物和载体引物PCR扩增，都能得到目的片段;双酶切能切下目的基因片段。基因测序表明，表达质粒中，目的基因片段未发生框移，与融合基因同框表达。3.2 CYP4EZr6基因原核蛋白表达和鉴定 从经鉴定过的阳性克隆菌JMI的中，将重组表达质粒pGex一6PI/CYP4EZr6用冰冷CaC12法转入表达菌种BL21，经37“。条件下不同浓度IpTG不同时间诱导表达后，收集细菌，加100井11/Loading Buffer煮沸南京医科大学硕卜学位论文变性后做SDs一PAGE，考马斯亮兰染色鉴定蛋白大小。阳性样本做SDS一PACE后，电转至NC膜上，多克隆杭家蝇P450杭体、GST抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠工gG作为二杭，通过Western blotting鉴定阳性带蛋白。 结果:用ltnM的工PTG诱导菌液Zh后，和空载相比能看到一条大约4 ZkD的蛋白带，和设计一致。目的基因推导蛋白约16kD，加上载体融合部分26KD，总蛋白分子量约42kD左右。Western blotting检测显示，在NC膜上分子量约42kD处有明显的显色条带，初步鉴定表达蛋白为目的蛋白。蛋白纯化正在进行中。3.3多克隆杭家蝇P450杭体的制备 用家蝇含P45O的混合蛋白，通过长程免疫小鼠的方法，制备小鼠抗家蝇P45O多克隆抗体。等比例混合弗氏完全佐剂和家蝇P450混合蛋白SDS一PAGE胶成油包水状，小鼠背部皮下多点注射，巧天后用弗氏不完全佐剂与抗原等比例混合加强免疫，又15天后完全抗原加强免疫。免疫45天后眼球取血分离小鼠抗血清，血清标记分装，以此多抗western blot检测抗性品系淡色库蚊四龄幼虫原核表达蛋白。 结果:成功制备多克隆抗家蝇P4 50抗体，检测到pGex一6PI/CYP4EZr6融合蛋白表达。