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目的:糖尿病患病率逐年增加,已经成为全球性健康问题。有研究报道,内源性大麻素系统(Endocannabinoid system,ECS)在调节食欲、糖和脂代谢方面均发挥着重要作用。ECS的活化可有效增强机体食欲、降低骨骼肌葡萄糖摄取、促进脂肪组织、肝脏组织及骨骼肌组织中脂肪储存,使机体能量异常蓄积,最终可导致肥胖的发生,其在维持机体能量代谢稳态、改善肥胖、胰岛素抵抗等方面发挥着重要作用。大麻素(Cannabinoids,CB)主要通过激活大麻素受体(Cannabinoids receptor,CBR)参与中枢摄食行为的调控,尤其是1型大麻素受体(Cannabinoids receptor 1,CB1R)被认为是众多大麻素类物质的靶向分子。近期有研究显示,主要参与调控学习记忆的中枢—海马,对糖尿病及其并发症的发生发展有重要影响。有研究报道,糖尿病db/db小鼠的海马内锥体细胞形态出现异常;海马内CB1R与胰高血糖素受体(GLP-1R)呈现共表达。但大麻素对糖尿病大鼠摄食、胃动力影响,以及GLP-1R信号通路是否参与该过程的调控目前未见报道。本研究拟采用单细胞外放电记录、核团微量注射以及在体胃运动等方法,观察海马CA1区大麻素对糖尿病大鼠摄食及胃运动的影响及潜在机制,为临床糖尿病、肥胖等代谢障碍性疾病的防治提供可信实验依据。方法:1.制备I型糖尿病大鼠模型:随机选取SD大鼠(220 g-250 g),造模前禁食12 h,单次腹腔注射65mg/kg的链脲佐菌素(STZ,sigama)。72 h后取尾静脉血测空腹血糖,血糖高于7.0 mmol/L和餐后血糖高于11.1 mmol/L为I型糖尿病大鼠建模成功。2.采用单细胞外放电记录,海马CA1区微量注射大麻素、大麻素受体拮抗剂Rimonabant或GLP-1受体激动剂Exendin-4,观察糖尿病大鼠海马CA1区胃牵张(gastric distension,GD)敏感神经元放电活动的影响;3.海马CA1区微量注射大麻素、Rimonabant或Exendin-4,观察对正常和糖尿病大鼠0-4h及4-8h摄食量的影响。本部分实验分别选取正常大鼠(n=36)和糖尿病大鼠(n=36),各分别随机分为6组(n=6):(1)NS组(海马CA1区注射0.5μL NS),(2)CB组(海马CA1区注射0.5μL 0.5μL 4μg CB),(3)Rimonabant组(海马CA1区注射0.5μL 3μg Rimonabant),(4)Exendin-4组(海马CA1区注射0.5μL 2.5μg Exendin-4),(5)CB+Rimonabant组(海马CA1区注射0.5μL 3μg Rimonabant+0.5μL 4μg CB混合液),(6)CB+Exendin-4组(海马CA1区注射0.5μL 2.5μg Exendin-4+0.5μL 4μg CB混合液)。通过摄食测量笼测定给药后大鼠0-4 h和4-8 h摄食量;4.海马CA1区微量注射大麻素、Rimonabant或Exendin-4,观察正常和糖尿病大鼠在体胃运动改变。本部分实验分别选取正常大鼠(n=36)和糖尿病大鼠(n=36),各随机分为6组(n=6):(1)NS组(海马CA1区注射0.5μL NS),(2)CB组(海马CA1区注射0.5μL 0.5μL 4μg CB),(3)Rimonabant组(海马CA1区注射0.5μL 3μg Rimonabant),(4)Exendin-4组(海马CA1区注射0.5μL 2.5μg Exendin-4),(5)CB+Rimonabant组(海马CA1区注射0.5μL 3μg Rimonabant+0.5μL 4μg CB混合液),(6)CB+Exendin-4组(海马CA1区注射0.5μL 2.5μg Exendin-4+0.5μL 4μg CB混合液)。药物经置管注射至大鼠海马CA1区,观察其对大鼠胃收缩幅度和收缩频率的影响。胃收缩信号由应力感受器传至胃肠运动换能器,在此转变为电信号输入计算机,由Powerlab多道生物信号采集处理系统对胃肠运动数据进行分析。5.采用荧光免疫组织化学染色方法,观察和比较正常与糖尿病大鼠海马CA1区大麻素受体表达的异同。结果1.海马CA1区微量注射大麻素对正常和糖尿病大鼠GD神经元放电活动的影响结果显示:(1)在35只正常大鼠海马CA1区共记录到109个放电神经元,其中69个(69/109,63.30%)神经元对胃牵张有反应,被鉴定为GD反应神经元。在69个GD反应神经元中,37个(37/69,53.62%)神经元放电频率显著增加,鉴定为GD-E神经元;而另外32个(32/69,46.38%)神经元放电频率下降,鉴定为GD-I神经元;在这37个GD-E神经元中,海马CA1区微量注射CB,26个神经元(29/48,60.42%)放电活动显著降低(P<0.05,7.07±1.15 Hz vs.2.26±0.93 Hz),平均降低68.03±6.15%(P<0.05);在32个GD-I神经元中,海马CA1区微量注射CB,其中有19个神经元放电频率显著加快(P<0.05,5.92±1.27 Hz vs.2.53±0.68 Hz),平均增幅57.26±3.23%(P<0.05)。若海马CA1区内预先注射CB1R拮抗剂Rimonabant,可完全阻断CB诱导的抑制/兴奋作用,表明CB可能通过作用于其受体CB1R调节GD神经元电生理特性;此外,若预先海马CA1区注射GLP-1受体激动剂Exendin-4,再给予CB,CB对GD-E神经元的抑制作用或对GD-I神经元的兴奋作用可被部分阻断(P<0.05);若海马CA1区单独注Rimonabant或Exendin-4,GD敏感神经元放电活动无显著改变(P>0.05),表明,GLP-1信号通路可能参与CB对正常大鼠海马CA1区GD-E或GD-I反应神经元兴奋性的调控;(2)在35只糖尿病大鼠海马CA1区共记录到127个放电神经元,其中86个(86/127,67.72%)神经元对胃牵张有反应,被鉴定为GD反应神经元。在86个GD反应神经元中,48个(48/86,55.81%)神经元放电频率显著增加,鉴定为GD-E神经元;而另外38个(38/86,44.19%)神经元放电频率下降,鉴定为GD-I神经元;在这48个GD-E神经元中,海马CA1区微量注射CB,其中29个神经元放电频率显著降低(P<0.01,8.76±1.21 Hz vs.1.41±0.67 Hz),平均降低83.90±4.2%;若海马CA1区预先注射CB1R拮抗剂Rimonabant可完全阻断CB诱导的抑制效应(P<0.05);在这38个GD-I神经元中,海马CA1区微量注射CB,其中有17个神经元放电频率显著加快(P<0.01,2.96±0.58 Hz vs.5.57±1.09 Hz),平均增幅88.18±2.7%。CB对糖尿病大鼠GD-I神经元的兴奋作用可被预先海马CA1区注射Rimonabant完全阻断(P<0.05),提示,CB对GD-I神经元的兴奋/抑制作用可能与糖尿病大鼠海马CA1区CB1R信号通路有关;此外,若预先向海马CA1区注射GLP-1受体激动剂Exendin-4,再给予CB,CB对GD-E神经元的抑制作用或对GD-I神经元的兴奋作用可被部分阻断(P<0.05),但糖尿病大鼠海马CA1区单独注射Rimonabant或Exendin-4,GD反应神经元的放电活动无显著改变(P>0.05)。提示,GLP-1信号通路可能也参与CB对糖尿病大鼠海马CA1区GD-E或GD-I反应神经元兴奋性的调控;(3)海马CA1区注射CB对正常和糖尿病大鼠GD反应神经元放电活动的影响组间比较结果显示,与正常大鼠相比,CB对糖尿病大鼠GD-E神经元的抑制效应显著增加(68.03±6.15%vs.83.90±4.2%,P<0.05);且CB对糖尿病大鼠GD-I神经元的兴奋作用明显强于正常大鼠(57.26±3.23%vs.88.18±2.7%,P<0.05)。2.海马CA1区微量注射大麻素对正常和糖尿病大鼠摄食量的影响结果显示:(1)在正常大鼠,与NS组相比,海马CA1区注射CB可显著增加大鼠0-4h的摄食量,但对4-8h摄食量无显著影响;若海马CA1区注射Rimonabant和CB混合液,CB促摄食作用消失;若海马CA1区注射CB和Exendin-4混合液,与单独注射CB相比,大鼠0-4h摄食量显著降低。但单独注射Rimonabant或Exendin-4对大鼠摄食没有明显影响(P>0.05)。(2)在糖尿病大鼠,与NS组相比,海马CA1区注射CB,大鼠0-4 h摄食量显著增加,但4-8 h摄食量无显著改变(P>0.05);若海马CA1区注射Rimonabant和CB混合液,可阻断CB的促摄食作用;若海马CA1区注射CB1+Exendin-4混合液,与单独注射CB相比,大鼠0-4 h摄食量显著降低。同样,但单独注射Rimonabant或Exendin-4对大鼠摄食没有明显影响(P>0.05)。(3)正常和糖尿病大鼠摄食量的影响结果组间比较显示,与正常大鼠相比,海马CA1区注射CB糖尿病大鼠0-4h摄食量增加更为显著(P<0.05)。3.海马CA1区微量注射大麻素对正常和糖尿病大鼠胃运动的影响结果显示:(1)在正常大鼠,海马CA1区微量注射CB,大鼠胃收缩幅度和频率均显著增加(P<0.05),若海马CA1区注射Rimonabant和CB混合液,CB促胃运动效应(收缩幅度和频率)可被完全阻断(P<0.05);若海马CA1区注射CB和Exendin-4混合液,CB对胃运动的促进效应减弱(P<0.05)。但单独注射Rimonabant或Exendin-4对大鼠胃运动没有明显影响(P>0.05);(2)在糖尿病大鼠,海马CA1区微量注射CB,大鼠胃收缩幅度和频率均显著增加(P<0.05);若大鼠海马CA1区注射CB+rimonabant混合液,CB促胃运动效应(收缩幅度和频率)可被完全阻断(P<0.05);此外,若海马CA1区注射CB+exendin-4混合液,CB对胃运动的促进作用可被部分阻断(P<0.05)。单独注射rimonabant或exendin-4对大鼠胃运动有明显影响(P>0.05);(3)正常和糖尿病大鼠胃运动的影响结果组间比较显示,与正常大鼠相比,海马CA1区注射NS,正常大鼠与糖尿病大鼠的胃运动指数无显著差异(P>0.05),海马CA1区注射CB,糖尿病大鼠胃运动指数升高更为显著(P<0.05)。4.荧光免疫组化研究显示,正常和糖尿病大鼠海马CA1区均有CB1R免疫阳性神经元,但糖尿病大鼠CB1R免疫阳性细胞表达明显多于正常大鼠(P<0.05)。这进一步证实了海马CA1区有大麻素作用靶点,且大麻素促摄食和胃动力调控效应在促糖尿病大鼠比正常大鼠作用强可能与CB1R表达增加有关。结论:CB参与正常大鼠及糖尿病大鼠海马CA1区GD反应性神经元放电活动、摄食及胃运动功能的调控,该效应可能主要通过激活CB1R通路而实现;大麻素在糖尿病大鼠对GD神经元兴奋性、摄食或胃运动调控作用较正常大鼠为强,可能与海马CA1区CB1R表达增加有关,这也为大麻素促摄食和胃动力效应提供了形态学依据。