番茄是重要的蔬菜作物,深受人们的喜爱,是全球消费最多的蔬菜之一。种子是生命的开始,对植物的生命进程具有重要作用。种子休眠是指在适宜的条件下,具有生活力的成熟种子仍然不发芽的现象。种子通过感知外界的环境变化打破休眠,从而开始生命的进程,帮助植物躲避不利的环境条件。种子萌发后,植株进入营养生长阶段,开始面临各种复杂的环境条件。不利的环境条件会导致减产,严重时会导致植株的死亡。果实是番茄的可食用器官,具有很高的营养价值。随着社会的发展,人们对番茄果实外观品质的要求也越来越多样化。同时,正常的果实发育及成熟为下一代的繁殖提供有力的保障。因而研究番茄的种子休眠、果形发育及逆境响应具有重要的意义。本研究克隆和鉴定了控制种子休眠关键基因MAPK11、果形发育基因PT及逆境响应基因ATL78L,并采用分子生物学、生物化学及细胞学等方面的方法解析这三个基因的功能。主要研究结果如下:一、MAPK11调控番茄种子休眠的机理1、通过对255份番茄自然群体种子休眠的关联分析,共鉴定出8个与番茄种子休眠显著相关的位点。其中,2个位点与已知基因AAO3、ABI5紧密相关,说明本研究中关联分析的可靠性。进一步,我们将最高点(ch07＿62133707,P-value＜5.28×10-17)所在的位点命名为TOMATO SEED DORMANCY ON CHROMOSOME 7（TSD7）,进行后续的研究分析。2、对TSD7进行分析,发现最高点SNP位于MAPK11基因内部。进一步在不同材料中重测序,发现MAPK11启动子区域的变异引起HSE的变化,从而改变种子的休眠性。而对不同材料的表达分析也佐证了MAPK11是位点TSD7的候选基因。3、对MAPK11进行功能互补验证,发现MAPK11超量转基因种子的发芽速率低于对照TS-9;干涉转基因的发芽速率高于对照TS-34。因而,MAPK11能促进种子的休眠,是位点TSD7的关键基因。4、ABA处理实验表明,MAPK11超量种子萌发对ABA超敏感,而ABA抑制剂促进超量植株种子的萌发。进一步转录分析和ABA含量测定发现,MAPK11正调控ABA合成关键基因NCED1的转录,促进ABA的合成,从而促进种子的休眠;此外MAPK11位于GA合成基因KAO的下游,GA20OX,GA3OX和GA2OX的上游,负调控GA的合成。5、磷酸化蛋白组分析表明,MAPK11影响体内Sn RK2.2的磷酸化水平,使Sn RK2.2的Ser-154和Thr-301磷酸化,从而参与ABA信号通路,促进种子的休眠。6、我们发现MAPK11与Sn RK1蛋白互作,增强Sn RK1的稳定性,并磷酸化Sn RK1的Ser-29。同时Sn RK1和ABI5蛋白互作,并在转录水平负调控ABI5的表达,从而影响ABA信号和种子的休眠和萌发。此外,转基因验证发现,Sn RK1抑制种子的休眠,是种子萌发所必需的。二、控制番茄果实果尖及成熟基因PT的克隆及功能研究1、通过对AC与LA4053 F2群体的BSA分析,共鉴定了控制果尖的4个位点。进一步对第5号染色体的位点精细定位,克隆了控制果尖的关键基因PT。2、对PT进行分析,发现外显子上单碱基的突变导致氨基酸的变化,形成两种不同的等位基因PTH和PTR。进一步预测,发现两种等位基因的蛋白空间结构的不同,进而可能导致对下游基因的调控出现差异。3、超表达PTR促进番茄形成果尖,rin能促使该果尖变的更加明显。此外,PTR通过结合ACO1的启动子正调控ACO1的转录,促进果实的成熟,而这种促进成熟的作用依赖于rin。4、超表达PTH形成无果尖梨形的果实,PTH能直接结合FUL2的启动子负调控FUL2的转录,敲除PTH解除PTH对FUL2的抑制作用,从而促进果尖的形成。三、ATL78L调控番茄非生物胁迫的机理1、通过对番茄耐寒材料LA1777、LA3969及冷敏感材料LA4024的芯片进行分析,在多毛番茄中克隆到冷诱导基因ShATL78L。ShATL78L在根、茎、叶、花、果等组织中组成型表达。和低温敏感番茄相比,ShATL78L在耐低温多毛番茄中受低温诱导上调表达。此外,ShATL78L也受干旱、高盐、高温、氧化及外源激素等的诱导。2、功能鉴定发现超表达ShATL78L能提升番茄耐低温、干旱及氧化胁迫的能力。进一步分子机制的研究发现RAV2能结合ShATL78L的启动子来改变ShATL78L的转录,同时ShATL78L和CSN5B蛋白互作来调控番茄非生物逆境胁迫的响应。