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研究目的富亮氨酸重复激酶2(leucine rich repeat kinase 2,LRRK2)是一个常染色体显性遗传PD的基因,它的突变产生的遗传性PD最为常见。统计数据显示,家系遗传PD患者占PD病例的10%,LRRK2突变的家系遗传PD患者大约占PD病例的7%。遗传性突变引起的LRRK2激酶活性增高是目前公认的PD发病机制之一,并且支持着现代临床药物的开发和应用。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是中草药制剂的有效成份,在体外细胞学实验中已证明是能有效抑制LRRK2激酶活性。本实验选用相应的转基因果蝇品系对EGCG的作用机制进行探究,验证其在在体实验时有无激酶活性抑制作用,并筛选出作用最佳浓度以及时间,进一步实验,研究它对LRRK2突变产生的遗传性PD的作用机制。方法Ddc-LRRK2-G2019S品系果蝇和对照组果蝇使用标准玉米培养基饲养,各实验组果蝇分别使用GW5074、NAC及不同浓度的EGCG配制的加药培养基饲养,检测并统计果蝇生命周期和运动能力,筛选出药物作用的最佳浓度与最适时间点;用蛋白印迹法检测果蝇脑组织匀浆中p-LRRK2、p-p38 MAPK、Nrf2、p-ERK1/2、TH表达。1.Ddc-LRRK2-G2019S品系果蝇,给予具有浓度梯度的EGCG,对照组果蝇使用标准玉米培养基饲养,各实验组果蝇分别使用GW5074、NAC及不同浓度的EGCG配制的加药培养基饲养,检测生命周期和运动能力并统计,筛选最佳的药物浓度,在生命周期和运动能力出现重大变化的时间段,用于下一步实验。2.使用Ddc-LRRK2-G2019S品系果蝇(或简称Ddc-GS2)作为实验组,Ddc-Gal4品系果蝇作为阴性对照组,N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)和GW5074作为阳性对照。饲养一定时间后,在体视显微镜下取出果蝇脑部进行观察,或提取脑组织匀浆用蛋白印迹法检测果蝇脑蛋白中p-LRRK2、p-p38 MAPK、Nrf2、p-ERK1/2、TH表达。确定适宜浓度的EGCG治疗由于LRRK2-G2019S突变导致的PD,延长PD模型果蝇的寿命和改善PD模型果蝇运动能力的可能机制。结果1、生命周期:EGCG显著延长果蝇寿命,改善果蝇运动能力,浓度为10μmol/L的EGCG组的寿命延长最明显。并且在第35天时生命周期曲线出现重大改变。半数生存时间的统计结果显示浓度为10 μmol/L的EGCG组有最显著性意义。2、运动能力:浓度为10μmol/L和1 μmol/LEGCG组的运动能力(攀爬)改变最明显,数据统计在第四、第五、第六、第七周有意义。在第五周统计学意义最为明显。3、蛋白分析显示EGCG能提高果蝇脑内Nrf2、p-ERK1/2、TH表达量,降低p-LRRK2、p-p38 MAPK表达量。这些结果提示EGCG能有效抑制LRRK2激酶活性,机制可能与Keap1-Nrf2-ARE通路和MAPK通路有关。结论1.给药浓度为10 μmol/L的EGCG的效果是相对比较明显的,体现在生命周期和运动能力的改善在35天左右,也即是在第五周时出现重大变化。2.与EGCG作用的可能信号通路:通过激活Nrf2,继而提高谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)基因表达,增加GSH的表达,产生抗氧化作用,提高细胞抗氧化应激的能力,保护了多巴胺神经元,对帕金森氏病起到一定的治疗作用。EGCG能有效抑制LRRK2激酶活性,可能通过p38 MAPK,p-ERK MAPK信号通路,起到保护多巴胺能神经元免受突变LRRK2诱导神经毒性的影响。