细胞是生命的基础,为了揭示生命活动的规律,必须对细胞结构和功能进行深入研究。肿瘤细胞具有与正常细胞不同的蛋白表达与代谢行为,且在单细胞水平上表现出高度异质性。系统研究复杂组织中肿瘤细胞的异质性可以使人们更好地了解癌症发生和发展的机制。传统的基于荧光分子标记的肿瘤细胞检测技术不可避免地会影响到细胞内的成分甚至干扰基因表达,也难以对肿瘤细胞的蛋白功能及代谢行为进行实时监测。为了获得准确且定量的生物学数据,迫切需要开发一种非侵入的,无标记的检测方法来探索肿瘤细胞的生理行为。扫描电化学显微镜（SECM）通过记录微区的电化学反应,可以无接触、无标记且高分辨率地描绘活细胞的形态及实时对细胞内的多种生理活动进行原位表征。此外,随着微流控技术的不断发展,微流控装置因具有微型化、易于集成以及高通量等优点已在生物学领域显示出其独特的优势和影响力。本论文主要致力于将SECM与微流控技术结合,对肿瘤细胞之间的异质性及其与基质成纤维细的差异性进行无标记且高通量的成像表征与分析。主要研究内容如下:1.结合SECM无标记成像与可拆卸微流控芯片的技术,提出了一种系统性研究不同三维（3D）细胞球体中细胞上蛋白活性与基因表达关系的新分析方法。3D肿瘤模型的构建可以使研究人员能够再现复杂的体内场景,从而更准确地对肿瘤的形态结构和膜蛋白表达进行分析。鉴于此,我们首先设计并制备了可拆卸的微流控装置,将肿瘤细胞（乳腺癌,MCF-7）和体细胞（基质成纤维细胞,NHDF）成功培养在同一块芯片上（85 ×4培养单元）。芯片开放后我们应用基于双媒介体的电压转换SECM（VSM-SECM）对芯片中3D细胞球体的干细胞标志物—碱性磷酸酶的表达进行了无标记成像与定量分析。后续可以精准地挑取单个细胞团块进行多基因表达分析。SECM成像结果表明,利用双媒介体多次扫描可以有效地消除基底形貌对细胞球体电化学信号的影响。3D乳腺癌细胞球体上方提取的表观异质速率常数kf（3.88×10-2 cm/s）是成纤维细胞球体（9.7×10-3 cm/s）的4.1倍。表明与正常细胞相比,肿瘤细胞表达更多的ALP,从而更具备成为肿瘤干细胞的潜力。随后特异性基因的实时荧光定量PCR实验进一步证实ALP的mRNA水平在乳腺癌细胞中表达上调且是成纤维细胞球体的8倍。相比成纤维细胞,其它的基因如多能性相关的转录因子SOX2,上皮标志基因MUC1,EPCAM等也在三维肿瘤细胞球体中显著表达,更深层次地揭示了乳腺癌细胞潜在的干性和转移性。该方法打破了之前SECM研究中一次实验只能表征少量同种细胞的局限性,允许我们在一次研究中同时获得三维细胞球的电化学信息与深层的下游分子生物学信息。这种工作体系能够为我们提供更加多维的细胞生物学信息,帮助我们更全面、深入地了解肿瘤细胞的生理特性。2.结合微流控单细胞捕获阵列芯片,建立了一个新的基于程序化SECM（P-SECM）的快速无标记高通量单细胞分析平台。传统SECM成像在对活细胞检测的场景中始终面临检测时间过长而无法实现同时对大量的单细胞进行分析的挑战。考虑到当执行简单的经过细胞的线扫描也可以收集到细胞的酶活性等关键电化学信息,通过将单细胞捕获在可寻址的微坑阵列中使其整齐排列,我们实施了基于线扫模式的程序化SECM,控制探针仅通过细胞上方等有效路径来收集细胞的酶活性信息。作为概念证明,我们应用该程序化SECM在1.2 h内完成了对900个（30×30）被聚苯乙烯小球占据的微坑阵列（区域大小为1400×1200 μm）的信息进行收集,检测时间是传统方法的1/10左右。此外,结合双媒介体电压转换模式,我们应用P-SECM在20min内定量检测了 82个单细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性,包括48个宫颈癌细胞（HeLa）和34个正常成纤维细胞（NHDF）。研究显示,我们发现在细胞上提取的表观异质速率常数和与细胞大小并不成正比,这个结果正可以作为细胞异质性的直接证据。48个HeLa细胞中最大kf（15.52×10-3 cm/s）是在34个NHDF细胞中最大kf（5.52×10-3 cm/s）的3.1倍,且相比于NHDF,HeLa单细胞的kf分布比较分散。这些结果揭示了宫颈癌细胞具有更高的ALP活性,且在单细胞水平上碱性磷酸酶的活性异质性更大。我们建立的通过将可寻址的微流控装置与程序化定义扫描路径的SECM相结合的新平台,可以为高通量无标记单细胞分析提供新的参考。3.用上述程序化SECM与微坑阵列结合的平台,通过单细胞水平上检测在二茂铁甲醇（FcMeOH）的刺激下多药耐药蛋白（MRP1）介导的谷胱甘肽（GSH）外排的动态变化,定量分析了肿瘤细胞氧化还原状态的变化,引入人工智能深度学习对702个单细胞进行了聚类分析。细胞的生长发育依赖于体内精细系统的平衡,细胞的氧化还原稳态是其中最重要的一部分。细胞内谷胱甘肽（GSH）的表达与肿瘤细胞的氧化还原状态息息相关。传统的基于荧光探针的检测方法难以对GSH的动态变化进行实时高通量的表征。鉴于此,我们应用基于双媒介体的电压转换SECM监测了二茂铁甲醇刺激不同时间时单个人非小细胞肺癌细胞（A549）和人类成纤维细胞（NHDF）外排GSH的动力学来研究其氧化还原状态的变化。我们发现三种不同表型（完全分裂的正常形态,细胞膜铺展较大的形态,正在分裂的双核形态）的A549细胞在相同时间的刺激下,三种形态细胞的GSH外排量随着刺激时间的延长而增加。当刺激时间达到75 min时,GSH外排达到稳定,提取的表观异相速率常数kf表现为以下关系:即双核形态的细胞（9.8×10-3 cm/s）＞铺展形态（7.6×10-3 cn/s）＞正常形态（4.5×10-3 cm/s）。相反的,NHDF细胞在二茂铁的刺激下,只有极少量GSH排出,其表观异相速率常数kf（0.8×10-3 cm/s）仅为A549细胞的1/6～1/12。之后,我们应用程序化SECM（P-SECM）与微坑阵列对捕获的702个单细胞的GSH外排的异质性进行了检测,结果显示在482个A549细胞中,最大的kf为9.83×10-3 cm/s,最小kf为0.05×10-3 cm/s。在220个NHDF细胞中,最大的kf为3.98×10-3 cm/s,最小kf为0.04×10-3 cm/s。且A549细胞kf变化范围更广。有接近1/3的A549细胞的kf要大于NHDF,表明在这些A549细胞内部还原态的GSH更多。最后我们并结合人工智能深度学习对702个单细胞进行了聚类分析。虽然基于细胞尺寸与GSH外排这两个维度的信息未能将捕获的细胞精准分型,但我们提出的这种分析方法无疑为高通量单细胞的异质性分析提供了十分有价值的参考。