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真菌应对渗透胁迫的途径包括高渗甘油途径(HOG,high osmolarity glycerol)在内的一系列调控网络,但其上游信号调控因子尚不明确。本文以禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)为研究对象,在盐胁迫(NaCl)下通过遗传学和生理生化手段,研究了一个关键的线粒体能量代谢酶基因丙酮酸脱氢酶激酶(FgPDK1)在调控渗透胁迫方面的重要作用。得到如下结果:1.FgPDK 敲除突变体(AFgPDK1)对盐胁迫的敏感性较野生型标准菌株(PH-1)显著增加。通过研究NaCl对Fgraminearum菌丝生长形态和孢子萌发的影响,发现不同浓度NaC1处理对野生型菌株PH-1生长的抑制作用呈现一定的浓度效应和时间效应。NaCl抑制PH-1生长的EC50为0.8 M,并显著抑制PH-1孢子萌发。另外,NaCl(0.8 M)对PH-1菌丝中FgPDK1基因的表达表现出最大的诱导效应。进一步研究NaCl(0.8 M)处理下△FgPDK1和PH-1的菌落生长,结果显示:△FgPDK1较PH-1表现出更为严重的生长抑制效应,而AFgPDK1恢复突变体(△FgPDK1-C)的生长与PH-1类似。扫描电镜(SEM)观察结果显示,盐胁迫下△FgPDK1菌丝表现出更为严重的断裂皱缩现象。2.FgPDK 能够维持NaCI胁迫下F.graminearum的活性氧稳态系统。采用生理生化测定和组织化学染色手段,研究了 NaCI(0.8M)胁迫下PH-1、△FgPDK1和△FgPDK1-C的氧化损伤、活性氧(ROS)积累和细胞死亡。与PH-1和△FgPDK1-C相比较,△FgPDK1在NaCl胁迫后菌丝细胞累积更多的ROS和丙二醛(MDA),且呈现出更强烈的细胞死亡现象。抗氧化酶基因表达分析结果显示,NaCl(0.8 M)处理后,三种菌株中的过氧化氢酶基因(CAT)表达均有所下调,但△FgPDK1中CAT的表达量显著低于PH-1和△FgPDK1-C。三种菌株中超氧化物歧化酶基因(SOD)的表达在NaCl(0.8 M)处理后均上调,但在△FgPDK1中的表达量显著低于PH-1和△FgPDK1-C。这些结果表明,盐胁迫下,FgPDK1可维持抗氧化酶基因的高表达水平,从而有助于清除过量累积的ROS。3.FgPDK1能够调控NaCl胁迫下Fgraminearum膜透性及甘油积累。与PH-1和△FgPDK1-C相比较,NaCl(0.8M)处理导致△FgPDK1菌丝细胞更为严重的电解质外渗和更高水平甘油累积。然而,NaCl胁迫下△FgPDK1菌丝中甘油合成酶基因(FgGDP1和FgGDP2)的表达水平却显著降低于PH-1和△FgPDK1-C,这与甘油累积趋势相反。真菌在渗透胁迫条件下,受Rgc1负调控的膜蛋白Fps1作用于甘油的外排。进一步研究发现,与PH-1和△FgPDK1-C相比较,NaCl胁迫下△FgPDK1菌丝中FgRgc1基因表达上调,进而导致受Rgc1负调控的甘油外排通道基因FgFpsl基因表达下调,从而导致甘油外排受阻。4.FgPDK1通过调控Fgraminearum中的HOG途径应对高渗胁迫。对HOG正向调控途径中的关键基因表达分析显示:NaCl(0.8 M)处理均能导致三种菌株中的FgHOG1及其上游正调控因子FgPbs2基因表达上调,但这两个基因的表达在△FgPDK1中显著低于PH-1和△FgPDK1-C,这与HOG途径终端基因GDP1和GDP2的表达趋势相一致。这些结果表明渗透胁迫下△FgPDK1中的HOG途径受到了抑制。进一步对HOG的负向调控途径研究显示:NaCl(0.8 M)处理导致三种菌株中的FgSln1和FgSSK1表达下调,受FgSSK1负调控的FgSSK2表达上调。NaCl胁迫下△FgPDK1中FgSlnl和FgSSK1的表达水平高于PH-1和△FgPDK1-C,FgSSK2则相反。这表明盐胁迫下△FgPDK1中的HOG的反向调控途径被激活。5.FgPDK1能够通过调控F.graminearum的离子平衡应对盐胁迫。与PH-1和△FgPDK1-C相比较,NaCl(0.8M)处理的△FgPDK1表现出更高的胞内Na+含量、更低的胞内K+含量、以及更高的胞内Na/K。基因表达分析显示:NaCl胁迫下,与PH-1和△FgPDKl-C相比较,AFgPDK1中的Na+内流通道基因FgENA1表达水平显著较高,而Na+外流通道基因FgNhal和K+内流通道基因FgTOK1、FgTrk1、FgNHX1则显著较低。这些结果说明,盐胁迫下FgPDK1通过调控相应的离子通道来维持胞内离子稳态。总之,本研究表明F.graminearum通过FgPDK1调控活性氧稳态、HOG途径、离子平衡来应对盐胁迫,为解析真菌适应渗透胁迫的分子调控机制提供了新证据。