人卵巢上皮性癌（Epithelial ovarian cancer,EOC,以下简称卵巢癌）起源于人卵巢表面上皮（ovarian surface epithelium,OSE）。卵巢癌约占卵巢所有恶性肿瘤的90%,其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位,但致死率在所有妇科恶性肿瘤中占首位,五年生存率仅30%左右。与近年来卵巢癌在手术方式、综合化疗等治疗方面取得的进展相比,卵巢癌的发病机制研究进展缓慢。本课题组早期利用基因芯片技术研究发现,与正常卵巢上皮相比,间皮素（Mesothelin,MSLN）基因是卵巢癌组织中差异表达最显著的基因之一。间皮素是MSLN基因编码的一种以糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上的糖蛋白,其前体蛋白N末端可被蛋白水解酶分裂释放出一个33KDa的可溶性蛋白,因其具有刺激巨核细胞活性作用,称之为巨核细胞促进因子（maturation promoting factor,MPF）,另外遗留下能与细胞膜结合的C末端（40 KDa）蛋白作为细胞粘附分子,称为间皮素。作为一种新发现的肿瘤细胞表面抗原,间皮素在正常组织中通常仅表达在体腔表面的间皮细胞,而在某些恶性肿瘤,如恶性间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌中过表达。间皮素在卵巢癌中的阳性率约75%,而在浆液型卵巢癌中,阳性率近100%。间皮素在卵巢癌中的特异性高表达,使其成为一个有前景的卵巢癌早期诊断标志。此外,本课题组还研究发现,间皮素能促进卵巢癌细胞的侵袭、粘附能力,使癌细胞抗失巢凋亡能力增强,并在卵巢癌细胞的耐药机制中起重要作用。做为一个新近发现的基因,间皮素的表达调控机制尚不清楚。Mary等在对鼠乳腺上皮细胞c57mg中不同Wnt信号功能差异的研究中偶然发现,与非经典Wnt/Ca2+通路不同,激活经典Wnt/β-catenin通路后,其下游靶基因上调最明显的为间皮素基因,即间皮素基因受Wnt/β-catenin信号通路调控,但并未进一步研究其调控机制。Wnt/β-catenin信号通路是高等动物胚胎组织发育分化过程中的的关键信号通路,可通过调节靶基因表达参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等。近年发现,这一途径异常在多种恶性肿瘤中显示出重要意义。Wnt-1蛋白是Wnt/β-catenin通路的信号分子,β-catenin是通路的关键分子,正常成熟细胞中不存异常的Wnt-1信号,细胞内游离的β-catenin水平也极低,当出现异常的Wnt-1信号时,通过与受体结合后激活一系列反应,抑制β-catenin降解,使细胞内游离β-catenin水平升高,进入细胞核与核内转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF）家族成员结合,刺激靶基因表达,如c-myc、cyclin D1、MMPs和VEGF等。另外,这些靶基因还可以做为转录调节因子,进一步调控某些基因的表达,这些基因一般称为间接靶基因。Wnt通路的直接和间接靶基因可引起细胞增殖异常,最终致使细胞癌变。已有报道在卵巢癌中存在着Wnt/β-catenin信号通路的异常,那么在卵巢癌中,该通路是否调控间皮素基因的表达呢?本课题首先从经典Wnt信号通路成分Wnt-1和β-catenin入手,检测其m RNA与蛋白在卵巢癌中的表达情况,以明确在卵巢癌中是否存在Wnt信号通路的异常激活,并同时检测间皮素基因的表达,分析二者的相关性,初步探讨卵巢癌中Wnt/β-catenin信号通路调控间皮素表达的可能性。进一步以SKOV-3细胞为例,探讨用Li Cl和Wnt-3a重组蛋白处理SKOV-3细胞模拟激活Wnt/β-catenin信号通路后,和用β-catenin靶向的RNAi慢病毒阻断Wnt/β-catenin信号通路后,间皮素基因的表达变化,以明确在体外Wnt/β-catenin信号通路是否对间皮素的表达有调控作用。最后,我们深入探讨了Wnt/β-catenin信号通路调控间皮素基因的机制,通过生物信息学预测分析间皮素基因的5’调控区及可能存在的调控元件,以双荧光酶报告基因系统检测间皮素基因启动子区的核心区域,并用电迁移率改变分析实验验证所预测的调控元件的作用,阐明Wnt/β-catenin信号通调控间皮素基因表达的具体机制。第一部分Wnt/β-catenin信号通路成分与间皮素在卵巢上皮性癌组织中的表达及相关性目的:探讨卵巢上皮性癌组织中Wnt/β-catenin信号通路成分Wnt-1和β-catenin与间皮素基因的表达,并分析其相关性。方法:用real-time PCR方法检测31例卵巢上皮性癌组织、20例良性卵巢上皮性肿瘤和10例正常卵巢上皮中经典Wnt信号通路成分Wnt-1和β-catenin基因和间皮素基因的m RNA的表达,并分析其在转录环节的相关性。用免疫组化Eli Vison法检测57例上皮性卵巢癌组织、20例良性卵巢上皮性肿瘤和16例正常卵巢上皮中Wnt-1、β-catenin基因和间皮素的蛋白表达;分析三者在不同组织类型、手术-病理分期间表达;分析间皮素与Wnt信号通路异常的相关性。结果:1卵巢癌组织中Wnt-1 m RNA的表达:Wnt-1 m RNA在卵巢癌组织中阳性表达率为22.6%（7/31）,阳性标本中相对表达量为0.64±0.06。卵巢良性肿瘤中有15%（3/20）为Wnt-1阳性表达,相对表达量为0.47±0.04。正常卵巢上皮组织中未检测出Wnt-1 m RNA表达（0/10）。卵巢癌与良性卵巢肿瘤间Wnt-1 m RNA阳性率无差异（x2=0.443,P>0.05）。卵巢癌与卵巢良性肿瘤间Wnt-1 m RNA阳性者表达量无差异（t=4.324,P>0.05）。因卵巢癌中Wnt-1 m RNA阳性表达例数较少,未在不同病理类型及病理分期间比较。2卵巢癌组织中β-catenin m RNA的表达:β-catenin m RNA表达于所有的组织标本。卵巢癌中β-catenin m RNA的相对表达量为0.77±0.46,卵巢良性肿瘤中为0.70±0.46,卵巢上皮组织中相对表达量为0.71±0.45,除透明细胞癌因例数少未参加统计外,β-catenin在浆液性、粘液性和子宫内膜样癌间表达无差异（F=0.55,P>0.05）。不同病理分期间III^IV期β-catenin m RNA相对表达量为0.96±0.06,高于I^II期的相对表达量0.70±0.03（t=-0.189,P<0.05）。3卵巢癌组织中间皮素基因m RNA表达:间皮素m RNA表达于93.5%（29/31）的卵巢癌,而卵巢良性肿瘤及正常卵巢上皮中无表达。间皮素m RNA表达在卵巢癌不同病理类型间表达无差异（F=2.942,P>0.05）。卵巢癌的III^IV期中间皮素m RNA表达与I^II期无差异（t=-0.788,P>0.05）。在m RNA水平,间皮素表达与Wnt-1、β-catenin均无相关关系。4 Wnt-1蛋白在卵巢癌组织中表达:Wnt-1蛋白表达于细胞质,在卵巢癌中表达率为43.9%,与良性卵巢上皮肿瘤的20%无差异（x2=3.590,P>0.05）,但高于正常卵巢上皮的5%（x2=10.637,P<0.05）,后二者间表达无差异（P=0.113）。Wnt-1蛋白在不同卵巢癌病理类型及病理分期间表达无差异。5β-catenin在卵巢癌组织中异位表达:β-catenin正常表达于细胞膜,异位表达于胞质或核。β-catenin在卵巢癌组织中异位表达率为75.4%,高于良性肿瘤的5%（x2=29.995,P<0.01）和正常卵巢上皮的无异位表达（x2=29.371,P<0.01）,后二者间无差异。子宫内膜样癌中β-catenin异位表达率为88.9%,高于粘液性癌组的50%,但只接近于有统计意义（P=0.051）。子宫内膜样癌与浆液性癌及粘液性癌间表达率无差异（P>0.05）。β-catenin异位表达在III^IV期中88.2%,高于I^II期的56.5%（x2=7.447,P<0.01）。6间皮素蛋白在卵巢癌组织中表达:间皮素表达于细胞膜及细胞质,卵巢癌中间皮素阳性表达率为80.7%,显著高于良性卵巢上皮肿瘤和正常卵巢上皮的无表达（x2=40.091,P<0.01;x2=34.911,P<0.01）。间皮素在不同卵巢癌类型间无差异。在卵巢癌的III^IV期中表达度为91.2%,高于I^II期的65.2%（P<0.05）。7间皮素蛋白表达与Wnt-1/β-catenin通路异常的相关性:间皮素蛋白与Wnt-1蛋白表达间无相关关系（P>0.05）。与β-catenin异位间38/57例共表达,有明显正相关(r=0.405,P<0.05。Wnt-1蛋白表达与β-catenin异位间无相关性（P>0.05）。结论:上皮性卵巢癌中存在Wnt/β-catenin信号通路成分和间皮素的异常表达;经典Wnt/β-catenin通路异常和间皮素表达与高手术-病理分期相关;在上皮性卵巢癌中间皮素表达与经典Wnt/β-catenin通路异常有关。第二部分SKOV-3细胞中Wnt/β-catenin信号通路对间皮素基因表达的调控目的:通过体外实验,观察卵巢癌细胞系SKOV-3中分别激活与抑制经典Wnt/β-catenin信号通路后,间皮素基因的表达变化,以揭示经典Wnt/β-catenin信号通路对间皮素基因表达有无实际调控作用。方法:1检测卵巢癌细胞SKOV-3中间皮素基因的基础表达水平。2 Li Cl和Wnt-3a处理SKOV3细胞,KCl和正常培养基处理为对照,检测β-catenin的表达情况。评估Li Cl和Wnt-3a激活Wnt/β-catenin信号通路的细胞模型。3构建针对β-catenin基因的RNAi慢病毒,空载体慢病毒为对照,转染SKOV3细胞后,观察其对Wnt信号通路的干扰效果。4 Real-time PCR和western blot方法分别检测激活与阻断Wnt/β-catenin信号通路后间皮素基因的m RNA和蛋白水平的表达变化。结果:1 Li Cl和Wnt-3a处理SKOV3细胞后,Real-time PCR检测β-catenin m RNA的表达。Li Cl处理组β-catenin相对表达量为2.10±0.23,Wnt-3a处理组为1.75±0.19均明显高于正常培养基组的0.80±0.16和KCl对照组的0.97±0.33（F=22.635,P<0.01）。western blot检测Li Cl处理组β-catenin蛋白表达的平均OD值为2.411,Wnt-3a处理组为2.256,两组高于正常培养基组的1.195和KCl对照组1.316约2倍。说明Li Cl和Wnt-3a可模拟激活Wnt/β-catenin信号通路2成功构建β-catenin靶向的RNAi慢病毒。以β-catenin-RNAi-LV转染SKOV-3细胞,NC-RNAi-LV作为对照组,观察转染效率为80-90%。Real-time PCR检测β-catenin-RNAi-LV处理SKOV3细胞后,β-catenin m RNA相对表达量为处理前的0.23倍,干扰效率为77%。Western blot检测β-catenin-RNAi-LV处理SKOV3细胞后,β-catenin蛋白表达平均OD值为0.308,转染buffer组为1.195,空病毒组为1.086,干扰效率为75%。3 Li Cl、Wnt-3a模拟激活Wnt通路后检测间皮素基因的表达。Li Cl处理组间皮素m RNA相对表达量为0.57±0.07,Wnt-3a处理组为0.50±0.02,均显著高于空白处理组0.24±0.07和KCl处理组的0.25±0.04。Western blot检测模拟激活Wnt通路后间皮素蛋白表达变化,Li Cl处理组间皮素蛋白表达平均OD值为1.279,Wnt-3a处理组为1.146,而空白处理组为0.550,KCl处理组为0.513。Li Cl和Wnt-3a处理后,间皮素蛋白表达上调2倍以上。4 Bete-catenin靶向RNAi慢病毒阻断Wnt通路后,间皮素m RNA相对表达量为0.15±0.03,与空病毒组的0.22±0.08和空白对照组0.25±0.07相比,无显著性差异（F=1.781,P>0.05）。β-catenin慢病毒处理组间皮素蛋白表达平均OD值为0.415,与空病毒处理组的0.468和空白处理组的0.550相比,无显著表达下调。结论:在SKOV-3细胞中,经典Wnt/β-catenin信号通路对间皮素基因的表达有调控作用,激活该信号通路可的上调间皮素基因的表达,但阻断β-catenin不能有效下调间皮素基因的表达。第三部分人间皮素基因5’调控区生物信息学分析及相关调控元件初步鉴定目的:生物信息学方法利用各种生物信息数据库分析间皮素基因5’调控区相关信息,预测并实验验证间皮素基因的核心启动子区;预测并实验验证调控间皮素基因启动子区Wnt/β-catenin信号通路相关转录因子结合位点,分析Wnt信号调控间皮素表达的方式。方法:1综合间皮素基因更新信息。选取转录本2翻译起始位点上方4Kb序列,运用表达序列标签（expressed sequence tags,EST）、甲基化岛（Cp G island）、启动子和转录因子等相关数据库和软件,分析间皮素基因5’调控区相关信息,预测间皮素基因的启动子,预测5’调控区内存在Wnt/β-catenin信号通路相关转录因子结合位点,推测Wnt信号调控间皮素表达的方式。2结合间皮素基因启动子区及转录因子结合位点位置的不同,构建不同长度间皮素启动子序列报告基因载体,转染卵巢癌SKOV-3及3AO细胞系,用双荧光酶报告基因系统检测不同长度启动子区活性,分析相应区域在间皮素转录调控中的作用。3电泳迁移率改变分析试验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）验证预测转录因子结合点的作用。结果:1与原有认为转录本1（Gen Bank accession:NM₀05823）编码MPF,转录本2（NM₀13404）编码间皮素,转录本2和1相比在N端序列存在差异,这种差异有可能来自测序错误;转录本3（AF180951）为间皮素c DNA部分序列,且C端插入82bp的认识不同,间皮素基因转录本信息已更新为:转录本1和3均转录间皮素前体蛋白亚型1,转录本2转录前体蛋白亚型2。前体蛋白亚型1和2均可加工为间皮素前体蛋白,后者被剪切为MPF与间皮素。2以间皮素基因翻译起始密码子记作+1,以上游-4Kb序列在Blast N程序内进行对比分析,显示间皮素基因5’端序列对应EST集中在-1900^-1850左右和-1500^-1430左右区域。4Kb序列对应可翻译为蛋白质区位于约-2700^-4000区域内,与EST区无重复,说明对应的EST序列可能为5’UTR。间皮素基因5’端序列Cp G岛分别位于-2830^-2590和-1706^-1497区域。启动子预测显示:间皮素基因有两个可能的启动子区,第一个位于-2168^-1599区,转录起始点可能于相对翻译起始密码子的-1668位置,此转录起始点可能对应转录本2。预测的另一个核心启动子位于-2875-2825,转录起始点位于-2835,可能对应转录本1和3。人与小鼠间皮素基因5’端保守区位于-2360^-2060,-1910^-1760左右和-1150^-1左右区域。间皮素基因5’端保守转录因子结合位点主要位于-2005^-1994。综合分析所预测信息,认为所预测的转录起始点-1668接近CpG岛,位于对比的EST上方,在进化保守区内,与转录本2第一外显子接近,可能为转录本2的起始位点。所预测的转录起始点-2835虽附近有Cp G岛,但无对应EST序列,不在进化保守区内,所以附近作为启动子区的可能较小。保守转录因子结合位点主要位于-2005^-1994区与现提交的转录本1和3第一外显子接近,并与-2168^-1599区重合,故推测间皮素基因3个转录本有共用一个启动子的可能。3取间皮素转录本2上游2Kb（-1608^-3608）序列分析可能的TCF/LEF转录因子结合位点,发现一个LEF-1结合位点,位于-3036^-3029,和一个TCF-4结合位点位于-1935^-1926,后者位于所预测启动子区内。4结合所预测的启动子及转录因子结合位点位置,构建含远端LEF-1结合位点及TCF-4结合位点的预测启动子区的1764bp（-3371^-1607）片段;仅含TCF-4位点的预测启动子区的472bp（-2079^-1607）片段;LEF-1与TCF-4结合位点均不包含的预测启动子区的261bp（-1868^-1607）片段。测序结果显示构建正确。三个不同长度启动子片断克隆至报告基因载体,转染SKOV-3及3AO细胞细胞后,荧光酶报告基因系统检测其相对活性,SKOV-3细胞中1764bp片段相对活性为76.3967±6.9207,472bp片段相对活性为62.1667±5.003,均明显高于261bp片段的7.900±0.9440（F=248.793,P<0.01）,前二者间相对活性无差异。3AO细胞中1764bp片段相对活性为64.4833±4.2174,472bp片段相对活性为48.3800±7.7385,均高于261bp片段的7.5433±1.4883相对活性值（F=150.624,P<0.01）。472bp片段报告活性与1764bp片段接近,从261bp片段报告活性明显下降,故而推测包含TCF-4转录因子结合位点的-2079^-1868（211bp）区为间皮素基因的核心启动子区。5电泳迁移率改变分析显示荧光标记的TCF-4探针能与核蛋白形成复合物,而突变型探针则不能,200倍未标记的竞争探针能竞争掉生物素标记的探针与核蛋白的结合,200倍未标记的突变探针则不能。且标记探针能与重组TCF-4蛋白结合。结论:1间皮素基因更新的Ref Seg序列已更正了以前转录本2、3存在的测序误差。转录本1和3均转录间皮素前体蛋白亚型1,转录本2转录前体蛋白亚型2。间皮素前体蛋白亚型1和2均可编码间皮素前体蛋白。2生物信息学综合分析显示,间皮素基因启动子区可能位于2835^-1668区域。间皮素基因5’调控区内有两个可能的TCF/LEF转录因子结合位点:一个LEF-1结合位点,位于-3036^-3029,一个TCF-4结合位点位于-1935^-1926,位于所预测启动子区内。3结合启动子区及TCF/LEF转录因子结合位点位置设计、构建了不同长度的启动子片段,转染卵巢癌细胞后,经双荧光酶报告系统检测,鉴定了一个包含TCF-4结合位点的211bp间皮素核心启动子区。4 EMSA实验对核心启动子区内预测的TCF-4结合位点进行了验证,证明这一位点是调控间皮素基因表达的顺式作用元件,Wnt信号通路可通过TCF-4直接调控间皮素基因的表达。