目的线粒体是阿霉素(Doxorubicin,DOX)心脏毒性作用的关键靶标,DOX诱导的心肌损伤的发生与发展与线粒体功能障碍密切相关。氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(PGC-1α)是维持线粒体功能的重要分子,其介导的线粒体新生是维持线粒体数量平衡、保证线粒体正常功能的重要活动。DOX引发心脏毒性时会出现PGC-1α下调、线粒体新生障碍和线粒体功能紊乱,提示PGC-1α及其介导的线粒体新生障碍和线功能紊乱与DOX心肌毒性密切相关,但其具体调控方式和作用机制均不清楚。沉默信息调节因子2相关酶1(silent information regulation 2 homolog 1,SIRT1)是一种组蛋白去乙酰化酶,是PGC-1α去乙酰化激活酶。有研究发现SIRT1缺失会导致PGC-1α乙酰化水平升高和活性降低,加剧心肌线粒体损伤,提示SIRT1去乙酰化修饰是PGC-1α及与其相关的线粒体功能的重要调控机制。本研究假设SIRT1通过PGC-1α去乙酰化修饰和线粒体功能调节发挥其抗DOX心肌毒性作用。希望阐明DOX心脏毒性中SIRT1/PGC-1α在线粒体功能调节中的相互关系和作用特点,为深入探索DOX心脏毒性新机制、临床毒副作用防治提供新思路。方法1.本研究首先对考察了SIRT1激活(激活剂RSV)或抑制(siRNA基因敲降)条件下,DOX所致细胞毒性、线粒体新生障碍和线粒体功能的变化,论证SIRT1在DOX所致心肌线粒体毒性作用机制中的重要靶标作用。SIRT1激活研究选择了表征线粒体功能的指标,如采用流式细胞检测法检查细胞ROS和超氧化物含量、荧光显微成像技术检查线粒膜电位、试剂盒检查ATP含量、CS活性等指标。同时还考察了反映线粒体新生的一系列指标,如Real-Time PCR检查mtDNA拷贝数变化、荧光显微成像技术检查线粒含量、Western blot检查PGC-1α介导的新生通路蛋白表达;并利用试剂盒检测了SIRT1酶活性、IP和Western Blot方法检查了SIRT1蛋白表达及PGC-1α的乙酰化水平变化,以考察SIRT激活对整个细胞和线粒体新生和功能的有益作用。随后利用siRNA瞬时转染构建SIRT1敲降细胞模型。利用该SIRT1敲降细胞考察DOX对细胞毒性、线粒体功能和新生的影响,分别考察了线粒体功能指标如细胞ROS、MMP、ATP含量,线粒体新生指标如mtDNA拷贝数、线粒体含量等,以论证SIRT1在维持正常细胞和线粒体功能、线粒体新生中的关键作用。2.本研究随后考察了SIRT1在EPO发挥心脏保护中的关键作用。通过Western blot初步确定EPO对SIRT1有激活作用后,对EPO的保护效果与SIRT1是否有关进行考察。通过流式细胞术检测线粒体内超氧化物含量、JC-1染色荧光酶标法测定MMP以观察EPO抗DOX线粒体功能损伤作用;通过Western blot考察线粒体新生通路PGC-1α、NRF1、TFAM蛋白表达、线粒体内参蛋白VDAC、COXIV蛋白表达、PCR检测mt DNA拷贝数变化以观察EPO抗DOX线粒体新生障碍的作用。还着重检测了EPO抗DOX引起的SIRT1酶活性和蛋白表达降低以及PGC-1α乙酰化水平升高。为进一步确定EPO的抗DOX毒性作用依赖于SIRT1存在,再次利用SIRT1敲降细胞进行实验,选择线粒体功能指标如线粒体超氧化物含量、ATP含量和MMP;线粒体新生指标如新生通路相关蛋白表达进行考察。3.最后本研究比较了单次给药和重复给药对细胞存活率和SIRT1/PGC-1α通路的影响。首先根据BMD(基准剂量法)利用BMDS2.5.0软件拟合细胞生存率曲线,比较低剂量重复给药后的细胞与单次给药细胞的IC50和存活率BMDL值的变化;接着用Western blot检测相同累积剂量不同给药频率单次给药和重复给药细胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达的不同。结果1.SIRT1在RSV抗DOX毒性中的关键作用。实验结果显示,DOX对AC16细胞生存率、线粒体新生和功能、SIRT1去乙酰化酶活性都有明显抑制作用。而RSV能够显著提高同等DOX剂量下心肌细胞的存活率,改善线粒体功能,如降低ROS生成、改善MMP降低、CS活性抑制。RSV还能改善DOX对线粒体新生通路的抑制,逆转阿霉素引起的线粒体DNA拷贝数降低,增强线粒体新生,增加线粒体数量。同时Western Blothe和IP结果也显示,DOX引起的SIRT1活性降低和PGC-1α乙酰化水平的升高均受RSV的保护而发生明显改善。同时,SIRT1敲降则加剧DOX对线粒体新生、线粒体结构和功能的影响。SIRT1敲降细胞在相同DOX给药下存活率更低、线粒体DNA拷贝数和线粒体含量也降低更多,提示SIRT1表达降低会引起线粒体新生障碍。荧光显微成像结果也显示SIRT1敲降加剧了DOX导致的线粒体MMP的降低、ATP合成降低和ROS堆积,线粒体功能受到更加严重的破坏。RSV的保护作用也因为SIRT1敲降而显著削弱。2.EPO抗DOX心脏毒性新机制与SIRT1的关系。实验首先确认AC16细胞中EPOR的存在及EPO对SIRT1的确具有激活作用。接着实验考察了给药24 h的DOX引起AC16细胞毒性和线粒体功能障碍,以及EPO的保护作用。EPO能够显著改善DOX引起的AC16细胞生存率降低、线粒体功能障碍和线粒体新生障碍,如缓解DOX线粒体内超氧化物堆积、SOD和CS表达降低以及MMP降低。同时,Western Blot和Real-time PCR结果显示EPO还能够显著改善DOX引起的线粒体新生抑制,表现为缓解DOX造成的PGC-1α通路相关蛋白表达下降、mtDNA拷贝数降低、SIRT1和PGC-1α的mRNA表达降低。DOX造成的SIRT1蛋白表达和活性抑制、PGC-1α乙酰化水平的升高,均由于EPO的保护作用发生显著改善。同时,SIRT1敲降细胞在相同DOX给药剂量下也表现出更大的细胞毒性、更严重的线粒体新生和功能障碍,具体表现为mtDNA拷贝数降低更多,超氧化物生成量增加、ATP含量、MMP等指标均较未敲降细胞降低更多,且EPO的保护作用也因为SIRT1的敲降而遭到明显削弱。提示EPO的保护作用依赖SIRT1存在。3.单次给药与重复给药对细胞重要指标的影响。方案A低剂量重复给药后的细胞与单次给药细胞的IC50和存活率BMDL值进行比较,发现低剂量重复给药3天的细胞较单次给药细胞对DOX毒性的耐受力显著提高,表现为IC50值和BMDL增大;而相同低剂量重复给药6天的细胞则较单次给药细胞对DOX毒性作用的耐受力显著降低,表现为IC50和BMDL降低。方案B相同累积剂量不同给药频率单次给药和重复给药细胞SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达结果进行比较,发现相同累积给药剂量下,重复给药导致SIRT1、PGC-1α及线粒体新生通路蛋白表达与单次给药相比呈现显著差异,重复给药较单次给药所造成的蛋白表达抑制更加严重。结论1.SIRT1是DOX毒性作用关键靶标,也是保护药物抗DOX毒性作用的潜在活性靶点。本研究展示了已知的SIRT1激动剂RSV和保护机制未知的EPO在抗DOX心肌毒性中所表现出相似的对SIRT1激活、对线粒体功能和线粒体新生的促进作用,发现该保护作用均表现为对SIRT1的依赖性。在DOX引起的心肌毒性中,SIRT1由于其脱乙酰酶活性受到抑制而对线粒体新生通路产生扰动,造成线粒体新生及线粒体结构、功能障碍;而SIRT1激活剂则能够明显对抗DOX引起的线粒体毒性,维持心肌细胞结构和功能的相对稳定。因此SIRT1有可能成为防治DOX心肌毒性的重要靶点,具有SIRT1激活作用的药物有希望作为DOX联合用药的保护药,减轻DOX临床毒副作用,具有临床现实意义。此外,SIRT1作为一种线粒体毒性通路关键分子,通过其自身活性变化和对目标分子的翻译后修饰调节,在维持心肌细胞正常生理功能中发挥重要作用;以此引申到其他翻译后修饰作用,也具有成为新的毒性作用靶标和治疗靶标的潜力和前景,这对于探索药物毒性作用新机制、寻找有效保护药物具有重要的现实意义。2.体外实验DOX单次给药和重复给药对生存率和蛋白表达产生不同影响。重复给药较单次给药引起细胞对DOX的IC50、生存率BMDL发生显著偏移;SIRT1/PGC-1α通路蛋白表达发生显著差异。提示单次给药和重复给药有可能涉及不同分子机制,需要进一步的详细全面的论证和更为深入的研究。