背景：　　 由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的结核病是当今世界上最普遍的人类传染病之一。由于全球艾滋病的流行、人口流动性的增加、耐多药菌株的出现和流行，使全球结核病的流行加重。因此结核病己成为威胁人类健康的最重要的疾病，是一个重要的全球公共卫生问题。中国是世界上22个结核病高发国家之一，结核病患者数量居世界第二位。2004年我国结核感染率为101/100，000，死亡率为17/100，000，而且新发病例中耐多药率为5.3％，复诊病人中耐多药率达27％，成为当前结核病控制中的难题。因此，通过监测结核病爆发流行、追踪结核病的传播途径，从而确定结核病的流行规律，并阐明各地区耐药株基因突变特征，这些对于我们掌握一个国家和地区结核病耐药性的严重程度和流行趋势，确定造成耐药性的原因具有举足轻重的作用。因而，加强结核病分子流行病学和耐药性监测研究已到了刻不容缓的地步。　　 目的：　　 1、建立MTB基因分型方法，包括插入序列611O为基础的限制性片段长度多态性(insertion sequence 6110-restriction fragment length polymorpism，IS611O-RFLP)、间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing，spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(multiple locus variable number oftandem repeat(VNTR)analysis，MLVA)，并评价它们在分子流行病　　 学研究中的应用价值；　　 2、了解北京地区MTB的基因型特点，选择适合北京地区MTB基因分型的方法；　　 3、建立MTB耐药相关基因突变的检测方法，包括检测利福平(rifampin，RIF)耐药相关基因rp0B的改进的RIFO(rifampin oligonucleotide)杂交方法，分别检测异烟肼(isoniazid，INH)耐药相关基因katG和inhA的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase clain reaction-restriction frragment length polymorphism，PCR-RFLP)和反向线性杂交技术(reverse line blot assay,RLB)，以及同时检测katG和inhA突变的碱基特异性多重PCR方法；　　 4、了解北京地区MTB耐药相关基因突变特点，评价不同耐药相关基因突变位点作为耐药监测分子标志的可行性以及不同的检测方法在临床上的应用价值。　　 材料和方法：　　 1、选取121株北京地区MTB菌株，首先采用spoligotyping进行基因分型；进一步对72株北京基因型菌株进行MLVA和IS611O-RFLP分型；最后比较三种基因分型方法的优缺点，从而确定北京地区的MTB基因分型方法；　　 2、对121株北京地区MTB菌株分别采用改进的RIFO杂交方法检测RIF耐药相关基因rPOB突变；PCR-RFLP和RLB技术分别检测INH耐药相关基因katG315和inhA突变；　　 3、运用碱基特异性多重PCR方法对其中102株MTB菌株同时进行INH耐药相关基因tatG和inhA检测，并与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果进行比较。　　 结果：　　 1、121株MTB菌株经spoligotyping分型发现，北京基因型占91.7％(111/121)，为北京地区的主要流行基因型；将72株北京基因型菌株进一步采用MLVA和IS611O-RFLP分型，结果MLvA分型共得到29个类型，其中基因型M29(223325173533)最为常见，包含33个菌株；有19个独特类型；分析的12个位点中，重复区26、40、31、10具有较高的多态性；IS611O-RFLP分型后共得到69个类型，其中66个(95.7％)独特类型，IS6110拷贝数都比较高，在10～23个之间；　　 2、121株MTB菌株中，采用改进的RIFO杂交检测发现91.5％(65/71)RIF耐药株和92.9％(52/56)的耐多药菌株(至少对RIF和INH耐药)存在rPoB基因核心区突变，RIF敏感株中未发现突变；PCR-RFLP和RLB结果显示INH耐药株中katG315AGC→ACC突变率为60.6％(40/66)，inkA(-15C/T)突变率为15.2％(10/66)，两者同时突变率为7.6％(4/66)，INH敏感株中没有发现katG315突变，而inhA(-15C/T)突变则达14.5％(8/55)；　　 3、采用碱基特异性多重PCR对102个MTB菌株检测发现，INH耐药株中60.3％(35/58)存在katG315突变，13.8％(8/58)发生了inhA突变，两者同时突变率为6.9％(4/58)，INH敏感株中没有发现katG315突变，而inhA突变率为18.2％(8/44)。检测结果与PCR-RFLP和RLB分别检测的结果完全一致，且等于两种方法结果之和，提示碱基特异性多重PCR可完全取代PCR-RFLP和RLB。　　 结论：　　 1、spoligotyping是鉴定MTB北京基因型的金标准，可作为大规模分子流行病学调查时初筛的手段；IS6110-RFLP分辨力高，是目前最为有效的MTB基因分型方法，也是MTB基因分型的金标准；MLVA操作简便，分辨力适中，且可通过增加分析位点来提高分辨力，是最有前途的基因分型方法；　　 2、北京基因型是北京地区的主要流行基因型；在对北京地区MTB菌株进行基因分型时不宜单独采用spoligotyping或MLVA作为分型依据，须结合IS611O-RFLP以达到良好的分辨力；　　 3、rp0B基因核心区可作为RIF耐药检测的分子标志及耐多药的筛选指标；对INH耐药菌株同时检测katG315和inhA基因，可以提高检出率；若inhA(-15C/T)单独出现突变，则可能存在低水平耐药，提示临床治疗时应适当加大INH的用量；　　 4、改进的RIFO杂交方法具有推广及潜在的应用价值；碱基特异性多重PCR可作为临床MTB菌株中INH耐药性检测的辅助手段。