弓形虫病(toxoplasmosis)是一种由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人兽共患寄生虫病,对于孕妇和免疫缺陷、免疫抑制者损害尤其严重。国内散养鸡的弓形虫感染率很高,平均在30%左右,被弓形虫感染的鸡体内会形成弓形虫包囊。生熟食未分开、食用未经充分烹调的鸡都有可能感染弓形虫。我国对散养鸡消费量很大,因此鸡弓形虫感染的检测对我国兽医公共卫生有着较重要的意义。禽畜弓形虫感染检测手段主要有病原学诊断、核酸检测和抗体检测技术三类方法。ELISA法有着采样简单,对检测设备要求低,检测结果敏感性高、特异性高的特点,是一种优良的检测手段。目前,市场上销售的鸡弓形虫抗体检测ELISA试剂盒存在抗体检出时间短,对感染后期抗体无法检出的缺点。这主要是由于这些试剂盒选用的弓形虫特异抗原效果不够好导致的。一些使用速殖子天然抗原制作的ELISA试剂盒更是存在特异性差、假阳性率高的问题。同时,国内外兽医研究单位对畜类弓形虫感染抗体检测技术研究较多,对禽类弓形虫感染检测研究较少,对鸡弓形虫感染检测的研究未见报道。为了增加禽类弓形虫特异性抗体的检测有效时间段和检测特异性,本实验通过Western blot、双向电泳、MALDI-TOF-TOF串联质谱鉴定相结合的方法筛选到了适宜的鸡弓形虫感染诊断抗原GRA8并进行了原核表达以及ELISA检测效果验证。本研究按照本实验室的赵光伟博士建立的弓形虫人工感染模型,给25只14日龄雏鸡腹腔注射107弓形虫速殖子,并采集了0-139d的感染鸡血清作为一抗,与弓形虫全虫蛋白进行了免疫印迹,筛选到了38KD和35KD两条抗原蛋白条带。在人工感染后7-95d,这两个蛋白条带与大多数感染鸡血清结合,在免疫印迹中呈强阳性反应。针对此分子量区域的蛋白,将大量全虫蛋白进行制备胶SDS-PAGE,参照预染Marker切下35-38KD的抗原蛋白条带,进行透析袋内的电洗脱回收和蛋白浓缩。分离到35-38KD蛋白,进行双向电泳,将电泳结果同时进行胶体考马斯染色和Western blot。根据Western blot结果切取染色胶上有阳性反应的抗原蛋白点,进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,确定了2个抗原候选蛋白：Porin和GRA8.以弓形虫速殖子cDNA为模板,根据NCBI上Porin和GRA8的mRNA序列设计引物,使用RT-PCR的方法扩增出了Porin和GRA8的ORF全长序列,克隆到原核表达载体pET-28a中,并转入大肠埃希氏杆菌BL21菌株进行IPTG诱导表达,His亲和层析,得到了较高纯度的Porin重组蛋白(rPorin)和GRA8重组蛋白(rGRA8)。使用14-45d感染鸡血清与重组蛋白进行Western blot, rPorin蛋白未见明显阳性反应,rGRA8蛋白呈强阳性反应,由于蛋白纯度高,rGRA8Western blot反应强度比弓形虫全虫蛋白大。使用rPorin和rGRA8蛋白包被ELISA板条,与4-128d感染鸡血清进行间接ELISA反应,rPorin蛋白ELISA结果中阳性血清孔与阴性血清孔差异不显著,证明rPorin无鸡弓形虫感染血清学诊断价值,rGRA8蛋白阴性与阳性孔差异明显,具有诊断价值。经过抗原包被量、一抗二抗浓度等反应条件的优化后,以rGRA8为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法在感染后7-28d对人工感染鸡的检测敏感性达到100%,45d内达到95%以上,63d内达到90%以上,139d内达到85%以上。特异性方面,用rGRA8蛋白检测鸡球虫(柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫),鸡大肠杆菌,禽流感病毒(H5型、H9型),鸡新城疫病毒,鸡法氏囊病毒等常见病原体感染血清均无交叉反应。该方法检测敏感性高,特异性高,是一个良好的鸡弓形虫感染诊断抗原,它的推广使用对于人畜共患的弓形虫病防控具有积极意义。