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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的一种常在定植菌,可以引发格拉泽氏病(Gl?sser’s disease),给养猪业带来巨大的经济损失。该病的主要病理特征为纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎和关节炎等,严重感染时引发败血症导致猪死亡。本试验以副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞为模型,以中药黄芩苷为干预药物,研究了黄芩苷在副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后对细胞凋亡及血管损伤的影响,并初步探讨了PKC-MAPK信号通路在黄芩苷缓解副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后细胞凋亡过程中的作用。此外,我们通过对副猪嗜血杆菌感染的血管内皮细胞进行转录组测序,探寻其他可能与血管损伤相关的分子机制。1.黄芩苷对副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后PKC-MAPK信号通路的影响。试验设空白对照组、副猪嗜血杆菌感染模型组、HPS及乙酰半胱氨酸(NAC)药物对照组和HPS及黄芩苷药物处理组(12.5、25、50、100μg/mL)。药物组先加入1 mM的NAC和相应浓度的黄芩苷预处理1 h,再加入终浓度为4×10~6CFU/mL副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞,共培养12 h后Western blot法测定PKC-MAPK信号通路相关蛋白(PKC-α、p-PKC-α、PKC-δ、p-PKC-δ、p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、Cleaved Caspase-3)的表达量;采用Q-RT PCR方法测定膜受体Rage、凋亡基因(Bax、Bcl-xl、C-myc、Fasl)和核转录因子AP-1(c-fos、c-jun)的mRNA表达水平;免疫荧光单标法观察核转录因子AP-1核转移情况;透射电镜观察细胞形变及HPS的侵染方式。结果表明,副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后,PKC-MAPK信号通路蛋白(p-PKC-α、p-PKC-δ、p-p38、p-ERK、p-JNK、Cleaved Caspase-3)表达量和膜受体Rage、凋亡基因(Bax、Bcl-xl、C-myc、Fasl)、核转录因子AP-1(c-fos、c-jun)的mRNA表达水平均极显著上调(p<0.01),核转录因子AP-1(p-c-jun荧光标记)核转移现象和细胞形变明显,HPS感染血管内皮细胞有附着在细胞膜上和侵入胞内两种方式;加入药物干预后,50和100μg/mL的黄芩苷极显著地下调PKC-MAPK信号通路蛋白(p-PKC-α、p-PKC-δ、p-p38、p-ERK、p-JNK、Cleaved Caspase-3)表达量和膜受体Rage、凋亡基因(Bax、Bcl-xl、C-myc、Fasl)、核转录因子AP-1(c-fos、c-jun)的mRNA表达水平(p<0.01),而且能明显抑制AP-1的核转移和改善细胞形变。2.黄芩苷对副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后细胞周期、活性氧的释放和细胞凋亡的影响。试验设空白对照组、副猪嗜血杆菌感染模型组、HPS及乙酰半胱氨酸(NAC)药物对照组和HPS及黄芩苷药物处理组(12.5、25、50、100μg/mL)。药物组先加入1 mM的NAC和相应浓度的黄芩苷预处理1 h,再加入终浓度为4×10~6 CFU/mL副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞,共培养12 h后采用流式细胞法检测细胞周期、活性氧的释放和细胞凋亡的情况。结果表明,副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后,细胞周期出现极显著地S期阻滞(p<0.01),活性氧的释放明显增多,细胞凋亡现象也极显著(p<0.01);加入药物干预后,各浓度的黄芩苷均能极显著地缓解细胞S期阻滞(p<0.01),均能明显抑制活性氧的释放,极显著地改善细胞凋亡的发生(p<0.01)。3.黄芩苷对副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后细胞粘附分子的影响。试验设空白对照组、副猪嗜血杆菌感染模型组、HPS及乙酰半胱氨酸(NAC)药物对照组和HPS及黄芩苷药物处理组(12.5、25、50、100μg/mL)。药物组先加入1 mM的NAC和相应浓度的黄芩苷预处理1 h,再加入终浓度为4×10~6CFU/mL副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞,共培养12 h后ELISA法测定细胞培养液中细胞粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1)的释放量;采用Q-RT PCR方法测定细胞粘附分子(E-selectin、ICAM-1、VCAM-1)的mRNA表达水平。结果表明,副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后,细胞培养液中E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的释放量和细胞中E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平都极显著地上调(p<0.01);加入药物干预后,100μg/mL的黄芩苷能极显著地抑制细胞培养液中E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的释放量和细胞中E-selectin、ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平。4.副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞的转录组测序分析。试验设空白对照组和HPS模型组两个处理组,每组3个重复。加入终浓度为4×10~6 CFU/mL副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞,共培养12 h后提取RNA样品进行转录组测序,并用Q-RT PCR法对所选取的12个差异表达基因进行了验证。结果表明,副猪嗜血杆菌感染血管内皮细胞后,有281个基因表达差异显著(p<0.05),其中236个基因表达上调,45个基因表达下调;在所选的12个基因中,与RNA-seq数据相比,9个基因显示出相似的表达水平,1个基因没有表现出明显的表达水平变化;FoxO信号通路表现非常活跃,参与了血管内皮细胞细菌感染的过程。综上所述,副猪嗜血杆菌感染猪血管内皮细胞后能激活PKC-MAPK信号通路并引起细胞凋亡,通过多种途径损伤血管内皮细胞。黄芩苷可能通过抑制PKC-MAPK信号通路而发挥抗凋亡作用,研究结果为副猪嗜血杆菌病的防治提供了一种新的策略。