稻瘟病菌AGC激酶功能分析及其潜在应用

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水稻稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的真菌性病害。广泛分布于世界各水稻种植区,发生时严重影响水稻产量,造成严重的经济损失。稻瘟病菌在水稻各个生长时期均可发生,其中穗颈瘟危害最为严重。稻瘟病菌具有典型的侵染循环,分生孢子通过风、雨水传播,落到植物表面,在合适的温度湿度下形成附着胞;附着胞内部积聚巨大的膨压,形成侵染栓侵入寄主植物细胞,侵染菌丝在细胞间扩展,引起病变,病斑形成新的分生孢子进行再次侵染。AGC激酶是一类传统的Ser/Thr蛋白激酶,在真核生物中高度保守。该家族很多激酶受TOR(target of rapamycin)调控,对细胞生长、发育以及生存具有重要的生理意义。本研究以稻瘟病菌AGC激酶为研究对象,通过基因敲除、表型分析、细胞学分析以及胁迫应答等实验,分析了AGC激酶在稻瘟病菌生长、发育和致病过程中的作用。通过同源序列比对,我们鉴定出22个AGC激酶家族基因,构建了12个基因敲除载体,最终得到7个基因敲除突变体:ΔMo07012、ΔMo01260、ΔMo05074、ΔMo10181、ΔMo09519、ΔMo02757、ΔMo12408;其中MGG00479、MGG15988、MGG01795、MGG06599、MGG08689基因不能被成功敲除;加上本实验室前期已有的四个AGC激酶基因敲除突变体ΔMo02051、ΔMo02061、ΔMo04475和ΔMo06514,我们对这11个基因缺失突变体进行了生长、产孢、致病性、胁迫应答以及对Rapamycin和Myriocin药物敏感性的实验分析。结果表明,ΔMo02757生长速率明显下降,且菌丝较厚;ΔMo07012、ΔMo02061、ΔMo05074、ΔMo06514产孢能力显著下降,其中ΔMo07012、ΔMo05074几乎不产孢;菌块接种大麦叶片离体实验表明,ΔMo05074的致病性减弱,ΔMo07012基本丧失致病性;Rapamycin和Myriocin敏感性实验表明,ΔMo06514、ΔMo01260、ΔMo12408、ΔMo07012、ΔMo04475对Rapamycin表现出更强的抗性;ΔMo02061、ΔMo10181、ΔMo09519、ΔMo02757对Rapamycin表现出更高的敏感性;ΔMo12408对Myriocin的敏感性显著上升,ΔMo02051、ΔMo10181、ΔMo05074、ΔMo06514、ΔMo07012、ΔMo02757、ΔMo01260对Myriocin表现出更强的抗性。这些结果说明,稻瘟病菌AGC激酶在调控稻瘟病菌生长发育、致病过程中发挥多样性的作用。稻瘟病菌AGC激酶MGG07012与酿酒酵母Fpk1同源,命名为MoFpk1;Fpk1主要参与调控内吞作用,细胞膜磷脂的不对称分布以及细胞壁的稳定性,从而维持胞内生理平衡,它对细胞生长、发育、生存具有重要意义;进而,我们对稻瘟病菌MoFpk1进行了细致的功能分析。MoFPK1基因缺失突变体ΔMofpk1,产孢能力显著下降;脂滴、糖原降解速率慢于野生型;ΔMofpk1的细胞壁完整性受损;类附着胞形成受阻,菌丝对寄主植物的致病性完全丧失,但分生孢子依然形成正常的附着胞,具有较强的致病能力。ΔMofpk1对Myriocin和Rapamycin表现出更高的抗性;Bodipy染色结果表明,ΔMofpk1在Rapamycin和Myriocin存在的条件下,脂滴融合和转运发生变化。MoFpk1激酶活性位点突变菌株MoFpk1K230R和MoFpk1D326A表型与ΔMofpk1类似,而MoFpk1D354A表型与野生型类似。通过qRT-PCR分析,我们发现参与调控类附着胞形成的关键基因MAC1、MST12、MSB2在ΔMofpk1中显著下调。在ΔMofpk1中,与脂滴合成代谢相关的基因MGG00057、MGG10005、MGG13626表达水平显著上升,MGG01925、MGG13793、MGG08074、MGG06888表达水平显著下降。与细胞自噬相关的基因MoATG3、MoATG11表达水平显著上升,MoATG1、MoATG15、MoATG29表达水平显著下降。以上结果表明,MoFpk1在稻瘟病菌生长、发育、类附着胞形成、致病以及脂滴代谢和运转过程中发挥重要作用,具有作为稻瘟病菌防治潜在靶标的可能。
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