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昆虫病原线虫共生菌是一类与线虫共生的革兰氏阴性细菌,包括发光杆菌属(Photorhabdus spp.)和致病杆菌属(Xenorhabdus spp.)。在自然界中,这类细菌主要存在于线虫体内,可以分泌多种毒力因子帮助线虫杀死昆虫。研究表明,III型分泌系统(T3SS)是病原菌分泌毒力因子的关键分泌系统,而T3SS在昆虫病原线虫共生菌中的功能机制尚未阐明。前期研究中,课题组从Photorhabdus luminescens TT01菌株中克隆了T3SS合成基因簇,并将接合转移元件重组至重组质粒中,为在Xenorhabdus stockiae HN_xs01中异源表达T3SS奠定了基础。本研究通过接合转移的方式将携带P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇的重组质粒转入HN_xs01菌株中,全基因组扫描表明:P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇成功整合至HN_xs01菌株染色体上。与野生型菌株相比,重组菌株HN_xs01-T3SS对枞色卷蛾中肠细胞CF-203的侵袭能力显著增强。同时,生测实验也表明:重组菌株HN_xs01-T3SS比野生型菌株HN_xs01对棉铃虫四龄幼虫具有更强的注射毒性。利用蛋白质组学技术,我们从重组菌株HN_xs01-T3SS鉴定到候选III型效应蛋白XopA和GogB类似物。接下来,我们对候选效应蛋白XopA和GogB进行了鉴定。首先构建了XopA和GogB原核表达载体,并成功将XopA和GogB原核表达载体分别转入野生型菌株HN_xs01和重组菌株HN_xs01-T3SS中。通过细胞孵育实验,我们发现重组菌株HN_xs01-T3SS中的XopA蛋白能高效分泌到CF-203和HeLa细胞,而野生型菌株中的XopA蛋白无法高效分泌到CF-203和HeLa细胞,证实XopA为致病杆菌HN_xs01菌株中的III型效应蛋白。为了进一步研究XopA蛋白的作用机制,我们构建了XopA真核表达载体,并转染至HeLa细胞中。免疫印迹结果显示XopA蛋白在HeLa细胞中得到成功表达;且XopA蛋白在细胞内表达会使细胞皱缩,细胞内出现大量空泡。MTT实验及细胞划痕实验表明XopA蛋白抑制HeLa细胞的增殖及迁移。接着通过透射电镜观察发现:XopA蛋白导致HeLa细胞皱缩,细胞内出现大量空泡,且细胞核固缩并出现核分叶等凋亡细胞的特征;同时通过Hoechst33342染色观察发现HeLa细胞核呈现致密浓染的块状蓝色荧光以及核破碎等凋亡细胞核特征,进一步证实XopA蛋白诱导HeLa细胞凋亡。通过对细胞内凋亡相关蛋白的表达的检测发现:XopA蛋白能使PARP蛋白发生剪切,Caspase-3的活性增加。免疫荧光结果显示XopA蛋白定位在HeLa细胞的细胞膜上,且XopA蛋白导致细胞骨架微管解聚,线粒体膜电位下降。最后,利用免疫共沉淀及质谱技术筛选出XopA结合蛋白主要为骨架蛋白和热休克蛋白HSP 90-β。综上,在对T3SS在HN_xs01的功能研究中,我们发现T3SS能够增强HN_xs01的致病力以及对真核细胞的侵袭能力。同时,我们证明了XopA蛋白是HN_xs01中的效应蛋白,并探究了该蛋白对人肿瘤细胞的细胞毒性,以及该蛋白细胞毒性的作用机理,为该类蛋白的应用研究奠定了理论基础。